DNA sequence

Prinsip Sekuensing DNA

Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau bahkan gen yang diinginkan. Namun, hal ini masih memerlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa fragmen tersebut benar-benar sesuai dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat dilakukan atas dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan.

Penentuan urutan (sekuensing) basa DNA pada prinsipnya melibatkan produksi seperangkat molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini dimigrasikan/dipisahkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) agar pembacaan sekuens dapat dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan sekilas dua macam metode sekuensing DNA.


...


Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.

Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.



Gambar 13.1. Contoh PAGE sekuensing dengan metode Maxam-Gilbert

Dari hasil PAGE pada Gambar 13.1 dapat diketahui sekuens fragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan fragmen yang salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan pita-pita pada lajur keempat.

Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa (Bab X), laju migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan ujung TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen DNA yang dipelajari.

Metode Sanger

Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga.

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya.

Pada Gambar 13.2 diberikan sebuah contoh sekuensing sebuah fragmen DNA. Tabung ddATP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran tiga dan tujuh basa; tabung ddCTP menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu, dua, dan empat basa; tabung ddGTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran lima dan sembilan basa; tabung ddTTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran enam dan delapan basa. Di depan (arah 5’) tiap fragmen ini sebenarnya terdapat primer, yang berfungsi sebagai prekursor reaksi polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil sekuensing karena urutan basa primer telah diketahui.

Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing tersebut dilakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui, dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen dengan ujung G (sembilan basa). Dengan demikian, hasil sekuensing yang diperoleh adalah CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasil sekuensing ini, yaitu GGTGCATAC.



Gambar 13.1. Skema sekuensing DNA

a) reaksi polimerisasi dan terminasi

b) PAGE untuk melihat ukuran fragmen

Pangkalan Data Sekuens DNA

Selama bertahun-tahun telah banyak sekuens DNA yang ditentukan oleh para ilmuwan di seluruh dunia, dan saat ini kebanyakan jurnal ilmiah mempersyaratkan penyerahan sekuens DNA terlebih dahulu untuk keperluan pangkalan data publik sebelum mereka menerima naskah selengkapnya dari para penulis/ilmuwan. Pengelola pangkalan data akan saling bertukar informasi tentang sekuens-sekuens yang terkumpul dan menyediakannya untuk akses publik sehingga semua pangkalan data yang ada akan menjadi nara sumber yang sangat bermanfaat.

Sekuens-sekuens baru terus bertambah dengan kecepatan yang kian meningkat. Begitu pula, sejumlah perangkat lunak komputer diperlukan agar data yang tersedia dapat dimanfaatkan dengan lebih baik.

EMBL di Eropa dan GenBank di Amerika Serikat merupakan dua pangkalan data sekuens DNA terbesar di dunia. Selain sekuens DNA, mereka juga mengelola data sekuens RNA dan protein. Sementara itu, beberapa perusahaan mempunyai pangkalan data sekuens DNA sendiri.

Ketika sekuens suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang dapat diperoleh dari sekuens tersebut. Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket perangkat lunak, misalnya paket GCG Universitas Wisconsin dan DNAstar.

Proyek-proyek Sekuensing Genom

Sejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA automatis (automatic DNA sequencer), sejumlah organisasi telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuens genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag λ telah disekuens seluruhnya. Genom sejumlah bakteri, misalnya E. coli (4,6 x 106 pb), dan khamir Saccharomyces cerevisiae (2,3 x 107 pb) juga telah selesai disekuens. Sementara itu, proyek sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 pb) dan nematoda Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek Genom Manusia (Human Genom Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.

Pada genom manusia dan genom-genom lain yang berukuran besar biasanya dilakukan pemetaan kromosom terlebih dahulu untuk mengetahui lokus-lokus gen pada tiap kromosom. Selanjutnya, perpustakaan gen untuk suatu kromosom dikonstruksi menggunakan vektor YACs (lihat Bab XI) dan klon-klon YACs yang saling tumpang tindih diisolasi hingga panjang total kromosom tersebut akan tercakup. Demikian seterusnya untuk kromosom-kromosom yang lain hingga akhirnya akan diperoleh sekuens genom total yang sambung-menyambung dari satu kromosom ke kromosom berikutnya.