the world of biology

DNA Molecular Biology Visualizations - Wrapping And Replication

2009-01-21T04:22:00.001+07:00

...

DNA Molecular Biology Visualizations - Wrapping And Replication

Pharmacology of Colchicine

2009-01-21T04:06:00.000+07:00

Colchicine, a water-soluble alkaloid found in the autumn crocus, blocks or suppresses cell division by inhibiting mitosis, the division of a cell's nucleus. Specifically, it inhibits the development of spindles as the nuclei are dividing. Normally, the cell would use its spindle fibers to line up its chromosomes, make a copy of them, and divide into two new cells with each daughter cell having a single set of chromosomes. With colchicine present, the spindle fibers don't form, and so the cell can't move its chromosomes around. The cell may end up copying some or all of the chromosomes anyway, but can't parcel them out into new cells, and so it never divides.
Because cancer cells divide much more rapidly than normal cells, cancers are more susceptible to being poisoned by mitotic inhibitors such as colchicine, paclitaxel, and the Vinca alkaloids.
However, colchicine has proven to have a fairly narrow range of effectiveness as a chemotherapy agent, so its only FDA-approved use is to treat gout (it is one of the active ingredients of ColBenemid, anti-gout tablets marketed by Merck & Co.), though it is also occasionally used in veterinary medicine to treat cancers in some animals. It is also used as an antimitotic agent in cancer research involving cell cultures.
Gout is an illness caused by faulty uric acid metabolism in which excess uric acid is turned into crystals of sodium urate, which are then deposited in the joints (most often in the big toe), causing inflammation and pain. Researchers aren't sure exactly how colchicine works against gout, but it does seem to reduce the frequency of severe attacks and relieves residual pain.
As far as side effects go, colchicine can cause a temporary reduction in the number of leukocytes (white blood cells) in the bloodstream; afterward, the leukocyte count can rebound to abnormally high levels. Colchicine also causes teratogenic birth defects in lab animals, and so pregnant women with gout should not use colchicine-containing drugs.
Colchicine poisoning resembles arsenic poisoning; the symptoms (which, because it is a mitotic poison, occur 2 to 5 hours after the toxic dose has been ingested) include burning in the mouth and throat, diarrhea, stomach pain, vomiting, and kidney failure. Death from respiratory failure often follows. A specific antidote doesn't exist, so treatment typically involves giving the victim activated charcoal or pumping the stomach.
...

Colchicine

2009-01-21T03:58:00.000+07:00

Colchicine is a toxic natural product and secondary metabolite, originally extracted from plants of the genus Colchicum (Autumn crocus, Colchicum autumnale, also known as the "Meadow saffron"). Originally used to treat rheumatic complaints and especially gout, it was also prescribed for its cathartic and emetic effects. Its present medicinal use is mainly in the treatment of gout; as well, it is being investigated for its potential use as an anti-cancer drug. It can also be used as initial treatment for pericarditis and preventing recurrences of the condition. In neurons, axoplasmic transport is disrupted by colchicine.

History

Colchicum extract was first described as a treatment for gout in De Materia Medica by Pedanius Dioscorides in the first century CE. Colchicine, an alkaloid, was first isolated in 1820 by the two French chemists P.S. Pelletier and J. Caventon.[1] The alkaloid was later identified as a tricyclic alkaloid, and its pain-relieving and anti-inflammatory effects for gout were linked to its ability to bind with tubulin.

...

Pharmacology
Biological function
Colchicine inhibits microtubule polymerization by binding to tubulin, one of the main constituents of microtubules. Availability of tubulin is essential to mitosis, and therefore colchicine effectively functions as a "mitotic poison" or spindle poison.[2] Since one of the defining characteristics of cancer cells is a significantly increased rate of mitosis, this means that cancer cells are significantly more vulnerable to colchicine poisoning than are normal cells. However, the therapeutic value of colchicine against cancer is (as is typical with chemotherapy agents) limited by its toxicity against normal cells.
Apart from inhibiting mitosis, a process heavily dependent on cytoskeletal changes, colchicine also inhibits neutrophil motility and activity, leading to a net anti-inflammatory effect. Colchicine also inhibits uric acid (urate) crystal deposition, which is enhanced by a low pH in the tissues, probably by inhibiting oxidation of glucose and subsequent lactic acid production in leukocytes. The inhibition of uric acid crystals is a vital aspect on the mechanism of gout treatment.

Colchicine as medicine
In the United States colchicine is FDA approved for the treatment of gout and also for familial Mediterranean fever, secondary amyloidosis(AA), and scleroderma. It is also used as an anti-inflammatory agent for long-term treatment of Behçet's disease.
The Australian biotechnology company Giaconda has developed a combination therapy to treat constipation-predominant irritable bowel syndrome which combines colchicine with the anti-inflammatory drug olsalazine.
The British drug development company Angiogene is developing a prodrug of colchicine, ZD6126(also known as ANG453) as a treatment for cancer.
Colchicine has a relatively low therapeutic index.
Colchicine is "used widely" off-label by naturopaths for a number of treatments, including the treatment of back pain.

Side effects
Side effects include gastro-intestinal upset and neutropenia. High doses can also damage bone marrow and lead to anaemia. Note that all of these side effects can result from hyper-inhibition of mitosis.

Toxicity
Colchicine poisoning has been compared to arsenic poisoning: symptoms start 2 to 5 hours after the toxic dose has been ingested and include burning in the mouth and throat, fever, vomiting, diarrhea, abdominal pain and kidney failure. These symptoms may set in as many as 24 hours after the exposure. Onset of multiple-system organ failure may occur within 24 to 72 hours. This includes hypovolemic shock due to extreme vascular damage and fluid loss through the GI tract, which may result in death. Additionally, sufferers may experience kidney damage resulting in low urine output and bloody urine; low white blood cell counts (persisting for several days); anemia; muscular weakness; and respiratory failure. Recovery may begin within 6 to 8 days. There is no specific antidote for colchicine, although various treatments do exist.

Botanical use
Since chromosome segregation is driven by microtubules, colchicine is also used for inducing polyploidy in plant cells during cellular division by inhibiting chromosome segregation during meiosis; half the resulting gametes therefore contain no chromosomes, while the other half contain double the usual number of chromosomes (i.e., diploid instead of haploid as gametes usually are), and lead to embryos with double the usual number of chromosomes (i.e. tetraploid instead of diploid). While this would be fatal in animal cells, in plant cells it is not only usually well tolerated, but in fact frequently results in plants which are larger, hardier, faster growing, and in general more desirable than the normally diploid parents; for this reason, this type of genetic manipulation is frequently used in breeding plants commercially. In addition, when such a tetraploid plant is crossed with a diploid plant, the triploid offspring will be sterile, which may be commercially useful in itself by requiring growers to buy seed from the supplier, but also can often be induced to create a "seedless" fruit if pollinated (usually the triploid will also not produce pollen, therefore a diploid parent is needed to provide the pollen). This is the method used to create seedless watermelons, for instance. On the other hand, colchicine's ability to induce polyploidy can be exploited to render infertile hybrids fertile, as is done when breeding triticale from wheat and rye. Wheat is typically tetraploid and rye diploid, with the triploid hybrid infertile. Treatment with colchicine of triploid triticale gives fertile hexaploid triticale.
When used to induce polyploidy in plants, colchicine is usually applied to the plant as a cream. It has to be applied to a growth point of the plant, such as an apical tip, shoot or sucker. Seeds can be presoaked in a colchicine solution before planting. As colchicine is so dangerous, it is worth noting that doubling of chromosome numbers can occur spontaneously in nature, and not infrequently. The best place to look is in regenerating tissue. One way to induce it is to chop off the tops of plants and carefully examine the lateral shoots and suckers to see if any look different.

The Design Of The Sperm

2009-01-21T03:36:00.000+07:00

...

That's HoW you were created.

Jesus Lizard

2009-01-21T03:31:00.000+07:00

...

Jesus lizard walking on the water

6 Degrees Warmer : Mass Extinction???

2009-01-21T03:18:00.000+07:00

...

If the world warms by six degrees, oceans will turn into marine wastelands and natural disasters become common events.

Global Warming

2009-01-21T02:57:00.000+07:00

...

Global warming could do more than just melt polar ice. It could change our maps, and displace people from cities and tropical islands.

Transgenic Organism

2009-01-21T02:54:00.000+07:00

Pemanfaatan Organisme Transgenik dan Produk yang Dihasilkannya

Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika telah melahirkan revolusi baru dalam berbagai bidang kehidupan manusia, yang dikenal sebagai revolusi gen. Produk teknologi tersebut berupa organisme transgenik atau organisme hasil modifikasi genetik (OHMG), yang dalam bahasa Inggris disebut dengan genetically modified organism (GMO). Namun, sering kali pula aplikasi teknologi DNA rekombinan bukan berupa pemanfaatan langsung organisme transgeniknya, melainkan produk yang dihasilkan oleh organisme transgenik. Dewasa ini cukup banyak organisme transgenik atau pun produknya yang dikenal oleh kalangan masyarakat luas. Beberapa di antaranya bahkan telah digunakan untuk memenuhi kebutuhan hidup sehari-hari. Berikut ini akan dikemukakan beberapa contoh pemanfaatan organisme transgenik dan produk yang dihasilkannya dalam berbagai bidang kehidupan manusia.

...

1. Pertanian

Aplikasi teknologi DNA rekombinan di bidang pertanian berkembang pesat dengan dimungkinkannya transfer gen asing ke dalam tanaman dengan bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens (lihat Bab XI). Melalui cara ini telah berhasil diperoleh sejumlah tanaman transgenik seperti tomat dan tembakau dengan sifat-sifat yang diinginkan, misalnya perlambatan kematangan buah dan resistensi terhadap hama dan penyakit tertentu.

Pada tahun 1996 luas areal untuk tanaman transgenik di seluruh dunia telah mencapai 1,7 ha, dan tiga tahun kemudian meningkat menjadi hampir 40 juta ha. Negara- negara yang melakukan penanaman tersebut antara lain Amerika Serikat (28,7 juta ha), Argentina (6,7 juta ha), Kanada (4 juta ha), Cina (0,3 juta ha), Australia (0,1 juta ha), dan Afrika Selatan (0,1 juta ha). Indonesia sendiri pada tahun 1999 telah mengimpor produk pertanian tanaman pangan transgenik berupa kedelai sebanyak 1,09 juta ton, bungkil kedelai 780.000 ton, dan jagung 687.000 ton. Pengembangan tanaman transgenik di Indonesia meliputi jagung (Jawa Tengah), kapas (Jawa Tengah dan Sulawesi Selatan), kedelai, kentang, dan padi (Jawa Tengah). Sementara itu, tanaman transgenik lainnya yang masih dalam tahap penelitian di Indonesia adalah kacang tanah, kakao, tebu, tembakau, dan ubi jalar.

Di bidang peternakan hampir seluruh faktor produksi telah tersentuh oleh teknologi DNA rekombinan, misalnya penurunan morbiditas penyakit ternak serta perbaikan kualitas pakan dan bibit. Vaksin-vaksin untuk penyakit mulut dan kuku pada sapi, rabies pada anjing, blue tongue pada domba, white-diarrhea pada babi, dan fish-fibrosis pada ikan telah diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan. Di samping itu, juga telah dihasilkan hormon pertumbuhan untuk sapi (recombinant bovine somatotropine atau rBST), babi (recombinant porcine somatotropine atau rPST), dan ayam (chicken growth hormone). Penemuan ternak transgenik yang paling menggegerkan dunia adalah ketika keberhasilan kloning domba Dolly diumumkan pada tanggal 23 Februari 1997.

Pada dasarnya rekayasa genetika di bidang pertanian bertujuan untuk menciptakan ketahanan pangan suatu negara dengan cara meningkatkan produksi, kualitas, dan upaya penanganan pascapanen serta prosesing hasil pertanian. Peningkatkan produksi pangan melalui revolusi gen ini ternyata memperlihatkan hasil yang jauh melampaui produksi pangan yang dicapai dalam era revolusi hijau. Di samping itu, kualitas gizi serta daya simpan produk pertanian juga dapat ditingkatkan sehingga secara ekonomi memberikan keuntungan yang cukup nyata. Adapun dampak positif yang sebenarnya diharapkan akan menyertai penemuan produk pangan hasil rekayasa genetika adalah terciptanya keanekaragaman hayati yang lebih tinggi.

2. Perkebunan, kehutanan, dan florikultur

Perkebunan kelapa sawit transgenik dengan minyak sawit yang kadar karotennya lebih tinggi saat ini mulai dirintis pengembangannya. Begitu pula, telah dikembangkan perkebunan karet transgenik dengan kadar protein lateks yang lebih tinggi dan perkebunan kapas transgenik yang mampu menghasilkan serat kapas berwarna yang lebih kuat.

Di bidang kehutanan telah dikembangkan tanaman jati transgenik, yang memiliki struktur kayu lebih baik. Sementara itu, di bidang florikultur antara lain telah diperoleh tanaman anggrek transgenik dengan masa kesegaran bunga yang lama. Demikian pula, telah dapat dihasilkan beberapa jenis tanaman bunga transgenik lainnya dengan warna bunga yang diinginkan dan masa kesegaran bunga yang lebih panjang.

Sentuhan teknologi DNA rekombinan pada florikultur antara lain dilakukan dengan mengisolasi dan memanipulasi gen biru dan gen etilen biru sesuai dengan tujuan yang dikehendaki. Di Amerika Serikat dan Eropa bibit violet carnation akan diproduksi melalui teknik rekayasa genetika. Bibit violet carnation transgenik ini disebut dengan moonshadow. Bunga moonshadow memiliki sangat sedikit benang sari, dan bahkan sesudah dipotong bunga tidak mempunyai benang sari lagi sehingga kemungkinan perpindahan gen ke tanaman lain dapat dicegah.

3. Kesehatan

Di bidang kesehatan, rekayasa genetika terbukti mampu menghasilkan berbagai jenis obat dengan kualitas yang lebih baik sehingga memberikan harapan dalam upaya penyembuhan sejumlah penyakit di masa mendatang. Bahan-bahan untuk mendiagnosis berbagai macam penyakit dengan lebih akurat juga telah dapat dihasilkan.

Teknik rekayasa genetika memungkinkan diperolehnya berbagai produk industri farmasi penting seperti insulin, interferon, dan beberapa hormon pertumbuhan dengan cara yang lebih efisien. Hal ini karena gen yang bertanggung jawab atas sintesis produk-produk tersebut diklon ke dalam sel inang bakteri tertentu yang sangat cepat pertumbuhannya dan hanya memerlukan cara kultivasi biasa.

Berbagai macam vaksin juga telah diproduksi menggunakan teknik rekayasa genetika, misalnya vaksin herpes, vaksin hepatitis B, vaksin lepra, vaksin malaria, dan vaksin kolera. Kecuali vaksin kolera, vaksin-vaksin tersebut dapat diproduksi dengan lebih efisien dan dalam jumlah yang lebih besar daripada produksi secara konvensional. Penggunaan vaksin malaria sangat diperlukan karena banyak nyamuk malaria yang saat ini sudah resisten terhadap DDT.

Contoh lain kontribusi potensial rekayasa genetika di bidang kesehatan yang hingga kini masih menjadi tantangan besar bagi para peneliti dari kalangan kedokteran dan ahli biologi molekuler adalah upaya terapi gen untuk mengatasi penyakit-penyakit seperti kanker dan sindrom hilangnya kekebalan bawaan atau acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Begitu juga, berkembangnya resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik masih membuka peluang penelitian rekayasa genetika di bidang kesehatan.

4. Lingkungan

Rekayasa genetika ternyata sangat berpotensi untuk diaplikasikan dalam upaya penyelamatan keanekaragaman hayati, bahkan dalam bioremidiasi lingkungan yang sudah terlanjur rusak. Dewasa ini berbagai strain bakteri yang dapat digunakan untuk membersihkan lingkungan dari bermacam-macam faktor pencemaran telah ditemukan dan diproduksi dalam skala industri. Sebagai contoh, sejumlah pantai di salah satu negara industri dilaporkan telah tercemari oleh metilmerkuri yang bersifat racun keras baik bagi hewan maupun manusia meskipun dalam konsentrasi yang kecil sekali. Detoksifikasi logam air raksa (merkuri) organik ini dilakukan menggunakan tanaman Arabidopsis thaliana transgenik yang membawa gen bakteri tertentu yang dapat menghasilkan produk untuk mendetoksifikasi air raksa organik.

5. Industri

Pada industri pengolahan pangan, misalnya pada pembuatan keju, enzim renet yang digunakan juga merupakan produk organisme transgenik. Hampir 40% keju keras (hard cheese) yang diproduksi di Amerika Serikat menggunakan enzim yang berasal dari organisme transgenik. Demikian pula, bahan-bahan food additive seperti penambah cita rasa makanan, pengawet makanan, pewarna pangan, pengental pangan, dan sebagainya saat ini banyak menggunakan produk organisme transgenik.

Permasalahan dalam Pemanfaatan Produk Teknologi DNA Rekombinan

Meskipun terlihat begitu besar memberikan manfaat dalam berbagai bidang kehidupan manusia, produk teknologi DNA rekombinan (organisme transgenik beserta produk yang dihasilkannya) telah memicu sejumlah perdebatan yang menarik sekaligus kontroversial apabila ditinjau dari berbagai sudut pandang. Kontroversi pemanfaatan produk rekayasa genetika antara lain dapat dilihat dari aspek sosial, ekonomi, kesehatan, dan lingkungan.

Aspek sosial

1. Aspek agama

Penggunaan gen yang berasal dari babi untuk memproduksi bahan makanan dengan sendirinya akan menimbulkan kekhawatiran di kalangan pemeluk agama Islam. Demikian pula, penggunaan gen dari hewan dalam rangka meningkatkan produksi bahan makanan akan menimbulkan kekhawatiran bagi kaum vegetarian, yang mempunyai keyakinan tidak boleh mengonsumsi produk hewani. Sementara itu, kloning manusia, baik parsial (hanya organ-organ tertentu) maupun seutuhnya, apabila telah berhasil menjadi kenyataan akan mengundang kontroversi, baik dari segi agama maupun nilai-nilai moral kemanusiaan universal. Demikian juga, xenotransplantasi (transplantasi organ hewan ke tubuh manusia) serta kloning stem cell dari embrio manusia untuk kepentingan medis juga dapat dinilai sebagai bentuk pelanggaran terhadap norma agama.

2. Aspek etika dan estetika

Penggunaan bakteri E coli sebagai sel inang bagi gen tertentu yang akan diekspresikan produknya dalam skala industri, misalnya industri pangan, akan terasa menjijikkan bagi sebagian masyarakat yang hendak mengonsumsi pangan tersebut. Hal ini karena E coli merupakan bakteri yang secara alami menghuni kolon manusia sehingga pada umumnya diisolasi dari tinja manusia.

Aspek ekonomi

Berbagai komoditas pertanian hasil rekayasa genetika telah memberikan ancaman persaingan serius terhadap komoditas serupa yang dihasilkan secara konvensional. Penggunaan tebu transgenik mampu menghasilkan gula dengan derajad kemanisan jauh lebih tinggi daripada gula dari tebu atau bit biasa. Hal ini jelas menimbulkan kekhawatiran bagi masa depan pabrik-pabrik gula yang menggunakan bahan alami. Begitu juga, produksi minyak goreng canola dari tanaman rapeseeds transgenik dapat berpuluh kali lipat bila dibandingkan dengan produksi dari kelapa atau kelapa sawit sehingga mengancam eksistensi industri minyak goreng konvensional. Di bidang peternakan, enzim yang dihasilkan oleh organisme transgenik dapat memberikan kandungan protein hewani yang lebih tinggi pada pakan ternak sehingga mengancam keberadaan pabrik-pabrik tepung ikan, tepung daging, dan tepung tulang.

Aspek kesehatan

1. Potensi toksisitas bahan pangan

Dengan terjadinya transfer genetik di dalam tubuh organisme transgenik akan muncul bahan kimia baru yang berpotensi menimbulkan pengaruh toksisitas pada bahan pangan. Sebagai contoh, transfer gen tertentu dari ikan ke dalam tomat, yang tidak pernah berlangsung secara alami, berpotensi menimbulkan risiko toksisitas yang membahayakan kesehatan. Rekayasa genetika bahan pangan dikhawatirkan dapat mengintroduksi alergen atau toksin baru yang semula tidak pernah dijumpai pada bahan pangan konvensional. Di antara kedelai transgenik, misalnya, pernah dilaporkan adanya kasus reaksi alergi yang serius. Begitu pula, pernah ditemukan kontaminan toksik dari bakteri transgenik yang digunakan untuk menghasilkan pelengkap makanan (food supplement) triptofan. Kemungkinan timbulnya risiko yang sebelumnya tidak pernah terbayangkan terkait dengan akumulasi hasil metabolisme tanaman, hewan, atau mikroorganisme yang dapat memberikan kontribusi toksin, alergen, dan bahaya genetik lainnya di dalam pangan manusia.

Beberapa organisme transgenik telah ditarik dari peredaran karena terjadinya peningkatan kadar bahan toksik. Kentang Lenape (Amerika Serikat dan Kanada) dan kentang Magnum Bonum (Swedia) diketahui mempunyai kadar glikoalkaloid yang tinggi di dalam umbinya. Demikian pula, tanaman seleri transgenik (Amerika Serikat) yang resisten terhadap serangga ternyata memiliki kadar psoralen, suatu karsinogen, yang tinggi.

2. Potensi menimbulkan penyakit/gangguan kesehatan

WHO pada tahun 1996 menyatakan bahwa munculnya berbagai jenis bahan kimia baru, baik yang terdapat di dalam organisme transgenik maupun produknya, berpotensi menimbulkan penyakit baru atau pun menjadi faktor pemicu bagi penyakit lain. Sebagai contoh, gen aad yang terdapat di dalam kapas transgenik dapat berpindah ke bakteri penyebab kencing nanah (GO), Neisseria gonorrhoeae. Akibatnya, bakteri ini menjadi kebal terhadap antibiotik streptomisin dan spektinomisin. Padahal, selama ini hanya dua macam antibiotik itulah yang dapat mematikan bakteri tersebut. Oleh karena itu, penyakit GO dikhawatirkan tidak dapat diobati lagi dengan adanya kapas transgenik. Dianjurkan pada wanita penderita GO untuk tidak memakai pembalut dari bahan kapas transgenik.

Contoh lainnya adalah karet transgenik yang diketahui menghasilkan lateks dengan kadar protein tinggi sehingga apabila digunakan dalam pembuatan sarung tangan dan kondom, dapat diperoleh kualitas yang sangat baik. Namun, di Amerika Serikat pada tahun 1999 dilaporkan ada sekitar 20 juta penderita alergi akibat pemakaian sarung tangan dan kondom dari bahan karet transgenik.

Selain pada manusia, organisme transgenik juga diketahui dapat menimbulkan penyakit pada hewan. A. Putzai di Inggris pada tahun 1998 melaporkan bahwa tikus percobaan yang diberi pakan kentang transgenik memperlihatkan gejala kekerdilan dan imunodepresi. Fenomena yang serupa dijumpai pada ternak unggas di Indonesia, yang diberi pakan jagung pipil dan bungkil kedelai impor. Jagung dan bungkil kedelai tersebut diimpor dari negara-negara yang telah mengembangkan berbagai tanaman transgenik sehingga diduga kuat bahwa kedua tanaman tersebut merupakan tanaman transgenik.

Aspek lingkungan

1. Potensi erosi plasma nutfah

Penggunaan tembakau transgenik telah memupus kebanggaan Indonesia akan tembakau Deli yang telah ditanam sejak tahun 1864. Tidak hanya plasma nutfah tanaman, plasma nutfah hewan pun mengalami ancaman erosi serupa. Sebagai contoh, dikembangkannya tanaman transgenik yang mempunyai gen dengan efek pestisida, misalnya jagung Bt, ternyata dapat menyebabkan kematian larva spesies kupu-kupu raja (Danaus plexippus) sehingga dikhawatirkan akan menimbulkan gangguan keseimbangan ekosistem akibat musnahnya plasma nutfah kupu-kupu tersebut. Hal ini terjadi karena gen resisten pestisida yang terdapat di dalam jagung Bt dapat dipindahkan kepada gulma milkweed (Asclepia curassavica) yang berada pada jarak hingga 60 m darinya. Daun gulma ini merupakan pakan bagi larva kupu-kupu raja sehingga larva kupu-kupu raja yang memakan daun gulma milkweed yang telah kemasukan gen resisten pestisida tersebut akan mengalami kematian. Dengan demikian, telah terjadi kematian organisme nontarget, yang cepat atau lambat dapat memberikan ancaman bagi eksistensi plasma nutfahnya.

2. Potensi pergeseran gen

Daun tanaman tomat transgenik yang resisten terhadap serangga Lepidoptera setelah 10 tahun ternyata mempunyai akar yang dapat mematikan mikroorganisme dan organisme tanah, misalnya cacing tanah. Tanaman tomat transgenik ini dikatakan telah mengalami pergeseran gen karena semula hanya mematikan Lepidoptera tetapi kemudian dapat juga mematikan organisme lainnya. Pergeseran gen pada tanaman tomat transgenik semacam ini dapat mengakibatkan perubahan struktur dan tekstur tanah di areal pertanamannya.

3. Potensi pergeseran ekologi

Organisme transgenik dapat pula mengalami pergeseran ekologi. Organisme yang pada mulanya tidak tahan terhadap suhu tinggi, asam atau garam, serta tidak dapat memecah selulosa atau lignin, setelah direkayasa berubah menjadi tahan terhadap faktor-faktor lingkungan tersebut. Pergeseran ekologi organisme transgenik dapat menimbulkan gangguan lingkungan yang dikenal sebagai gangguan adaptasi.

Tanaman transgenik dapat menghasilkan protease inhibitor di dalam sari bunga sehingga lebah madu tidak dapat membedakan bau berbagai sari bunga. Hal ini akan mengakibatkan gangguan ekosistem lebah madu di samping juga terjadi gangguan terhadap madu yang diproduksi.

4. Potensi terbentuknya barrier species

Adanya mutasi pada mikroorganisme transgenik menyebabkan terbentuknya barrier species yang memiliki kekhususan tersendiri. Salah satu akibat yang dapat ditimbulkan adalah terbentuknya superpatogenitas pada mikroorganisme.

5. Potensi mudah diserang penyakit

Tanaman transgenik di alam pada umumnya mengalami kekalahan kompetisi dengan gulma liar yang memang telah lama beradaptasi terhadap berbagai kondisi lingkungan yang buruk. Hal ini mengakibatkan tanaman transgenik berpotensi mudah diserang penyakit dan lebih disukai oleh serangga.

Sebagai contoh, penggunaan tanaman transgenik yang resisten terhadap herbisida akan mengakibatkan peningkatan kadar gula di dalam akar. Akibatnya, akan makin banyak cendawan dan bakteri yang datang menyerang akar tanaman tersebut. Dengan perkataan lain, terjadi peningkatan jumlah dan jenis mikroorganisme yang menyerang tanaman transgenik tahan herbisida. Jadi, tanaman transgenik tahan herbisida justru memerlukan penggunaan pestisida yang lebih banyak, yang dengan sendirinya akan menimbulkan masalah tersendiri bagi lingkungan

DNA sequence

2009-01-21T02:51:00.000+07:00

Prinsip Sekuensing DNA

Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau bahkan gen yang diinginkan. Namun, hal ini masih memerlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa fragmen tersebut benar-benar sesuai dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat dilakukan atas dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan.

Penentuan urutan (sekuensing) basa DNA pada prinsipnya melibatkan produksi seperangkat molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini dimigrasikan/dipisahkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) agar pembacaan sekuens dapat dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan sekilas dua macam metode sekuensing DNA.

...

Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.

Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Gambar 13.1. Contoh PAGE sekuensing dengan metode Maxam-Gilbert

Dari hasil PAGE pada Gambar 13.1 dapat diketahui sekuens fragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan fragmen yang salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan pita-pita pada lajur keempat.

Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa (Bab X), laju migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan ujung TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen DNA yang dipelajari.

Metode Sanger

Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga.

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya.

Pada Gambar 13.2 diberikan sebuah contoh sekuensing sebuah fragmen DNA. Tabung ddATP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran tiga dan tujuh basa; tabung ddCTP menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu, dua, dan empat basa; tabung ddGTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran lima dan sembilan basa; tabung ddTTP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran enam dan delapan basa. Di depan (arah 5’) tiap fragmen ini sebenarnya terdapat primer, yang berfungsi sebagai prekursor reaksi polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil sekuensing karena urutan basa primer telah diketahui.

Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing tersebut dilakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui, dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen dengan ujung G (sembilan basa). Dengan demikian, hasil sekuensing yang diperoleh adalah CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasil sekuensing ini, yaitu GGTGCATAC.

Gambar 13.1. Skema sekuensing DNA

a) reaksi polimerisasi dan terminasi

b) PAGE untuk melihat ukuran fragmen

Pangkalan Data Sekuens DNA

Selama bertahun-tahun telah banyak sekuens DNA yang ditentukan oleh para ilmuwan di seluruh dunia, dan saat ini kebanyakan jurnal ilmiah mempersyaratkan penyerahan sekuens DNA terlebih dahulu untuk keperluan pangkalan data publik sebelum mereka menerima naskah selengkapnya dari para penulis/ilmuwan. Pengelola pangkalan data akan saling bertukar informasi tentang sekuens-sekuens yang terkumpul dan menyediakannya untuk akses publik sehingga semua pangkalan data yang ada akan menjadi nara sumber yang sangat bermanfaat.

Sekuens-sekuens baru terus bertambah dengan kecepatan yang kian meningkat. Begitu pula, sejumlah perangkat lunak komputer diperlukan agar data yang tersedia dapat dimanfaatkan dengan lebih baik.

EMBL di Eropa dan GenBank di Amerika Serikat merupakan dua pangkalan data sekuens DNA terbesar di dunia. Selain sekuens DNA, mereka juga mengelola data sekuens RNA dan protein. Sementara itu, beberapa perusahaan mempunyai pangkalan data sekuens DNA sendiri.

Ketika sekuens suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang dapat diperoleh dari sekuens tersebut. Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket perangkat lunak, misalnya paket GCG Universitas Wisconsin dan DNAstar.

Proyek-proyek Sekuensing Genom

Sejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA automatis (automatic DNA sequencer), sejumlah organisasi telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuens genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag λ telah disekuens seluruhnya. Genom sejumlah bakteri, misalnya E. coli (4,6 x 106 pb), dan khamir Saccharomyces cerevisiae (2,3 x 107 pb) juga telah selesai disekuens. Sementara itu, proyek sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 pb) dan nematoda Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek Genom Manusia (Human Genom Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.

Pada genom manusia dan genom-genom lain yang berukuran besar biasanya dilakukan pemetaan kromosom terlebih dahulu untuk mengetahui lokus-lokus gen pada tiap kromosom. Selanjutnya, perpustakaan gen untuk suatu kromosom dikonstruksi menggunakan vektor YACs (lihat Bab XI) dan klon-klon YACs yang saling tumpang tindih diisolasi hingga panjang total kromosom tersebut akan tercakup. Demikian seterusnya untuk kromosom-kromosom yang lain hingga akhirnya akan diperoleh sekuens genom total yang sambung-menyambung dari satu kromosom ke kromosom berikutnya.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

2009-01-21T02:50:00.000+07:00

Pengertian dan Kegunaan PCR

Pada bagian akhir Bab IX telah disinggung bahwa fragmen pelacak yang diperlukan dalam seleksi rekombinan merupakan molekul DNA untai ganda yang urutan basanya harus komplementer dengan sebagian urutan basa fragmen (gen) yang dilacak. Fragmen pelacak ini dibuat secara in vitro menggunakan teknik PCR. Namun, teknik yang ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1987 ini, tidak hanya digunakan untuk membuat fragmen pelacak, tetapi secara umum teknik ini merupakan cara untuk menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara in vitro.

...

Komponen dan Tahapan PCR

Penggandaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.

DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer.

Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.

Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).

Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.

Gambar 12. 1. Putaran pertama PCR

Perancangan Primer

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.

Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.

Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer.

Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).

Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai Tm yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.

Gambar 12.2. Hasil PCR putaran kedua dan ketiga

Perpustakaan Gen

2009-01-21T02:46:00.000+07:00

Pengertian dan Macam Perpustakaan Gen

Suatu perpustakaan gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Pada dasarnya terdapat dua macam perpustakaan gen yang dapat dikonstruksi, bergantung kepada sumber DNA digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut perpustakaan genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA seperti yang umum dijumpai pada eukariot, maka perpustakaan yang diperoleh dinamakan perpustakaan cDNA.

Hal yang perlu diperhatikan ketika kita melakukan konstruksi suatu perpustakaan gen adalah bahwa perpustakaan tersebut harus merepresentasikan semua gen yang ada di dalam sumber DNA asalnya. Dengan perkataan lain, suatu perpustakaan gen dikatakan representatif apabila berisi semua sekuens aslinya. Selain itu, jika suatu perpustakaan tidak mengandung klon dalam jumlah yang mencukupi, maka sangat dimungkinkan hilangnya beberapa gen tertentu.

Untuk mendapatkan perpustakaan genom yang representatif, DNA genomik harus dimurnikan dan kemudian dipotong secara acak menjadi fragmen-fragmen yang ukurannya sesuai dengan keperluan kloning menggunakan vektor yang dipilih. Fraksionasi sel pada eukariot akan mengurangi kontaminasi oleh DNA organel (mitokondria, kloroplas). Oleh karena itu, pemurnian DNA genomik eukariot biasanya dilakukan dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus dan menghilangkan protein, lemak, serta makromolekul lain yang tidak diinginkan dengan memberikan protease dan melakukan ekstraksi fenol-kloroform. Sementara itu, DNA prokariot dapat diekstraksi langsung.

DNA genomik hasil pemurnian tersebut selanjutnya dipotong-potong secara acak. Pada dasarnya ada dua cara pemotongan, yaitu pemotongan fisik seperti sonikasi dan digesti menggunakan enzim restriksi. Pemotongan dengan enzim restriksi akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung tertentu (lihat Bab IX). Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif besar dilakukan digesti parsial dengan cara mengurangi jumlah enzim restriksi atau waktu pemotongan yang digunakan Dengan digesti parsial ini enzim restriksi tidak akan memotong DNA genomik pada setiap tempat pengenalan yang ada sehingga akan diperoleh fragmen-fragmen DNA genomik yang relatif panjang.

...

Besarnya Perpustakaan Gen

Besarnya suatu perpustakaan gen dilihat dari banyaknya rekombinan yang terdapat di dalamnya. Untuk menghitung banyaknya rekombinan yang harus ada di dalam suatu perpustakaan gen digunakan rumus sebagai berikut.

N = ln (1 – P) / ln (1 – f)

Pada rumus tersebut N adalah banyaknya rekombinan yang harus ada di dalam perpustakaan gen, P peluang yang diinginkan, dan f nisbah panjang fragmen sisipan terhadap panjang genom. Sebagai contoh, untuk mendapatkan fragmen sisipan berukuran 20 kb (20.000 pb) dengan peluang 0,99 diperlukan perpustakaan gen yang besarnya berbeda antara E .coli dan manusia.

N E. coli = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 4,6 x 106) = 1,1 x 103

N manusia = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 3 x 109) = 6,9 x 105

Kita bisa melihat bahwa banyaknya rekombinan yang diperlukan untuk mendapatkan fragmen dengan ukuran dan peluang yang sama ternyata berbeda, bergantung kepada panjang genom organismenya. Pada E. coli dengan panjang genom yang lebih pendek (4,6 x 106) daripada panjang genom manusia (3 x 109) diperlukan rekombinan yang lebih sedikit (1,1 x 103) daripada rekombinan untuk perpustakaan gen manusia (6,9 x 105).

Perhitungan seperti tersebut di atas juga dapat menjelaskan alasan bahwa apabila genom suatu prokariot dengan fragmen sisipan sepanjang 5 hingga 10 kb diklon menggunakan plasmid akan menghasilkan perpustakaan gen yang baik meskipun hanya membawa beberapa ribu rekombinan. Demikian pula, untuk genom-genom yang besar cukup diperlukan sedikit rekombinan meskipun fragmen sisipannya panjang. Penggunaan vektor yang dapat mengklon fragmen-fragmen panjang, misalnya kosmid dan YAC, memungkinkan konstruksi perpustakaan genom dengan jumlah rekombinan yang tidak terlalu besar.

Elektroforesis

Sebelum fragmen-fragmen DNA genomik hasil digesti restriksi diligasikan ke dalam suatu vektor tertentu (lihat Bab IX) terlebih dahulu perlu dilakukan pemeriksaan atas keberhasilan digesti tersebut. Untuk melihat keberhasilan digesti restriksi, DNA divisualisasikan menggunakan teknik elektroforesis. Namun, elektroforesis sendiri sebenarnya bukanlah teknik visualisasi DNA semata-mata karena teknik ini dapat juga digunakan untuk keperluan isolasi dan pemurnian fragmen DNA tertentu.

Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atas perbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Jika hubungan antara ukuran molekul dan laju migrasi dipetakan dalam suatu grafik logaritmik, maka akan diperoleh kurva linier. Oleh karena itu, kita dapat memperkirakan berat molekul suatu fragmen DNA dengan melihat atau membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya.

Fragmen-fragmen DNA divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet setelah terlebih dulu direndam di dalam larutan etidium bromid, pewarna yang akan menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa DNA. Perendaman dilakukan setelah migrasi dianggap cukup untuk dihentikan. Fragmen DNA akan nampak sebagai pita berwarna merah dengan posisi migrasi yang sesuai dengan berat molekulnya. Cara ini dapat memvisualisasikan fragmen DNA hingga sekecil 0,05 µg.

Seperti telah dikatakan di atas bahwa selain karena perbedaan ukurannya, laju migrasi DNA pada gel elektroforesis juga ditentukan oleh konformasi molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closed circular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusul berikutnya konformasi open circular (OC), dan yang terakhir linier. Oleh karena perbedaan konformasi menyebabkan perbedaan laju migrasi, maka penentuan ukuran suatu fragmen DNA selalu dilakukan pada konformasi linier.

Marilah kembali kita bicarakan visualisasi fragmen-fragmen DNA genomik hasil digesti restriksi. DNA genomik, baik yang utuh maupun yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi, perlu divisualisasikan pada gel elektroforesis. Begitu pula halnya dengan vektor utuh dan vektor yang telah dilinierkan serta vektor rekombinan hasil ligasi dengan fragmen DNA genomik (lihat Bab IX). Selain itu, molekul DNA marker yang telah diketahui ukurannya juga dimigrasikan sebagai standar untuk menentukan ukuran sampel-sampel DNA yang kita analisis.

DNA genomik utuh pada lajur 2 nampak sebagai pita dengan laju migrasi paling lambat. Jika dibandingkan dengan marker, akan terlihat bahwa ukurannya lebih besar dari 21,3 kb. Berikutnya pada lajur 3, DNA genomik yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu tervisualisasi sebagai pita melebar (smear). Pita ini merupakan kumpulan fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan tersebut yang sangat bervariasi ukurannya. Sementara itu, pada lajur 4 dan 5 terlihat jelas perbedaan laju migrasi antara plasmid utuh yang mempunyai konformasi CCC dan plasmid linier hasil pemotongan dengan suatu enzim restriksi. Plasmid linier bergerak lebih lambat daripada plasmid CCC, dan posisi migrasinya digunakan untuk menentukan ukurannya (sekitar 4,9 kb). Terakhir pada lajur 6, plasmid rekombinan hasil ligasi dengan fragmen DNA genomik menunjukkan ukuran yang lebih besar dari 4,9 kb. Hal ini terlihat dari migrasinya yang lebih lambat daripada plasmid linier tanpa fragmen sisipan.

Prosedur Skrining

Proses untuk mengidentifikasi suatu klon yang membawa gen tertentu yang diinginkan di antara sejumlah besar klon lainnya di dalam perpustakaan gen dinamakan skrining. Pada dasarnya skrining dilakukan dengan teknik hibridisasi menggunakan suatu molekul pelacak DNA (DNA probe). Beberapa pengetahuan mengenai gen yang akan dicari, atau produknya, diperlukan dalam pembuatan molekul pelacak bagi gen tersebut. Di dalam proses skrining, molekul pelacak akan menempel pada sekuens DNA yang komplementer dengannya sehingga klon yang diinginkan dapat dikenali.

Apabila diperoleh protein yang merupakan produk gen tertentu dalam jumlah yang memungkinkan untuk penentuan sekuens asam aminonya, maka dari informasi sekuens asam amino ini dapat disusun beberapa kemungkinan sekuens DNA yang menyandinya. Selanjutnya, informasi sekuens DNA yang disusun dapat digunakan untuk membuat molekul pelacak.

Hibridisasi koloni dan plak

Seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan vektor λ dilakukan dengan melihat terbentuknya plak pada medium kultur sel inang. Sementara itu, seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan plasmid dilakukan dengan melihat pertumbuhan koloni pada medium seleksi (lihat Bab XI). Namun, prosedur skrining bagi kedua sistem kloning tersebut pada dasarnya sama saja.

Langkah pertama adalah mentransfer DNA di dalam plak atau koloni ke suatu membran nilon atau nitroselulosa. Untuk plak, DNA λ dapat langsung diperoleh dan ditransfer ke membran karena plak merupakan area tempat keberadaan bakteri inang yang mengalami lisis. Akan tetapi, jika yang ditransfer ke membran adalah koloni-koloni bakteri, maka perlu dilakukan lisis sel bakteri untuk mendapatkan DNA. Sebelumnya, dibuat replika bagi koloni-koloni yang ditransfer tersebut di dalam medium kultur yang baru.

Lisis sel bakteri biasanya dilakukan dengan merendam membran nilon di dalam sodium dodesil sulfat (SDS) dan protease. Selanjutnya, DNA yang keluar dari sel didenaturasi menggunakan alkali sehingga diperoleh DNA untai tunggal, yang kemudian difiksasi ke membran dengan pengeringan atau iradiasi UV. Membran dicelupkan ke dalam larutan pelacak DNA dan diinkubasi agar terjadi hibridisasi antara pelacak, yang juga berupa untai tunggal, dan beberapa DNA untai tunggal yang komplementer dengannya. Pelacak DNA biasanya diberi label radioaktif.

Setelah hibridisasi, membran dicuci untuk menghilangkan sisa-sisa pelacak yang tidak terhibridisasi. Beberapa DNA di dalam membran yang mengalami hibridisasi divisualisasikan menggunakan autoradiografi dengan sinar X. Dengan membandingkan posisi DNA yang terhibridisasi oleh pelacak dengan posisi koloni pada kultur replika akan diketahui koloni-koloni yang membawa DNA rekombinan dengan fragmen sisipan yang diinginkan.

Gambar 10.3. Skema hibridisasi koloni / plak

Skrining ekspresi

Pada dasarnya skrining ekspresi sama dengan skrining perpustakaan gen melalui hibridisasi koloni/plak. Hanya saja pada skrining ekspresi, bukannya DNA yang dideteksi pada membran, melainkan protein yang merupakan produk suatu gen yang diinginkan. Sebagai pelacak digunakan antibodi, sedangkan untuk mengetahui terjadinya hibridisasi digunakan antibodi lain atau bahan kimia yang dapat mengenalinya. Dengan cara seperti ini dapat ditentukan koloni/plak yang mengekspresikan protein yang dikehendaki.

Penghambatan dan pelepasan translasi oleh hibrid

Klon-klon cDNA dapat digunakan untuk menghibridisasi mRNA yang diisolasi. Setelah dilakukan hibridisasi, populasi mRNA langsung ditranslasi menjadi protein. Translasi tidak akan terjadi pada segmen mRNA yang terhibridisasi oleh cDNA, atau dengan perkataan lain, translasi telah dihambat oleh hibrid (hybrid-arrest translation). Dengan mendeteksi produk-produk protein yang tidak terbentuk dapat diketahui cDNA yang menghambat translasi suatu protein. Artinya, cDNA ini dapat dipastikan membawa sekuens yang menyandi protein yang tidak ditranslasi tersebut.

Cara kebalikannya juga dapat dilakukan. Hibrid-hibrid antara cDNA dan mRNA dimurnikan. Kemudian, mRNA dilepaskan dari hibrid dengan pemanasan atau menggunakan agen denaturasi. Setelah itu, mRNA ditranslasi (hybrid-release translation) untuk menghasilkan produk protein tertentu. Dengan mengetahui protein yang terbentuk dapat diketahui klon cDNA yang membawa sekuens penyandi protein tersebut. Secara skema perbandingan kedua prosedur skrining tersebut dapat dilihat pada Gambar 10.4.

Southern blotting dan Northern blotting

Kedua prosedur skrining ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens tertentu tetapi tidak dilakukan langsung pada klon-klon rekombinannya. Skrining didasarkan atas hasil hibridisasi antara molekul asam nukleat dan pelacaknya pada gel agarosa. Istilah Southern blotting berasal dari nama penemunya, sedangkan Northern blotting diekstrapolasi dari nama tersebut. Jika Southern blotting ditujukan untuk DNA, Northern blotting digunakan untuk hibridisasi RNA.

Tahap pertama untuk kedua prosedur tersebut adalah migrasi molekul asam nukleat pada gel agarosa. Khusus untuk Southern blotting, dilakukan denaturasi DNA (biasanya menggunakan alkali) sehingga akan diperoleh DNA untai tunggal. Pita-pita untai tunggal, baik DNA maupun RNA, kemudian dipindahkan ke membran nilon atau nitroselulosa seperti halnya pada hibridisasi koloni.

Begitu asam nukleat dipindahkan ke membran, tahap-tahap selanjutnya pada kedua prosedur skrining tersebut sama, yaitu fiksasi asam nukleat pada membran, hibridisasi dengan pelacak, pencucian sisa pelacak, dan deteksi fragmen yang mengalami hibridisasi menggunakan autoradiografi. Di antara tahap-tahap tersebut kondisi hibridisasi merupakan faktor yang paling memerlukan perhatian. Jika antara pelacak dan sekuens target terdapat homologi yang sangat tinggi (mendekati atau sama dengan 100%), maka dapat diberlakukan kondisi hibridisasi yang ketat, yaitu dengan suhu hibridisasi tinggi dan konsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi. Sebaliknya, jika sekuens pelacak tidak terlalu homolog dengan sekuens target, maka ketetatan kondisi hibridisasi harus diturunkan sampai pada tingkatan yang memungkinkan terbentuknya hibrid-hibrid yang kurang sempurna. Namun, jika keketatannya diturunkan terlalu banyak, fragmen pelacak mungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lain yang tidak spesifik.

Southern blotting terhadap fragmen-fragmen DNA genomik yang diklon dapat dilakukan menggunakan pelacak berupa cDNA untuk mencari bagian-bagian klon genomik yang sesuai dengan fragmen cDNA pelacak. Jika fragmen DNA genomik yang membawa suatu gen tertentu dapat dideteksi, maka akan diketahui ukuran fragmen yang membawa gen tersebut. Blot-blot dengan sampel DNA atau RNA dari organisme yang berbeda (zoo blots) dapat menunjukkan betapa konservatifnya suatu gen di antara spesies yang satu dan lainnya.

Vektor Kloning

2009-01-21T02:42:00.000+07:00

Pengertian dan Macam-macam Vektor Kloning
Pada Bab IX antara lain telah dibicarakan bahwa transformasi sel inang dilakukan menggunakan perantara vektor. Jadi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor YACs dan YEps dapat digunakan pada khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40, dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.

...

Plasmid

Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:

mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,

mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,

mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan

mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.

Salah satu contoh plasmid buatan yang banyak digunakan dalam kloning gen adalah pBR322. Plasmid ini dikonstruksi oleh F. Bolivar dan kawan-kawanya pada tahun 1977. Urutan basa lengkapnya telah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun pengenalan restriksinya juga telah diketahui. Sayangnya, tempat pengenalan EcoR I, salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan, terletak di luar marker. Oleh karena salah satu marker akan menjadi tempat penyisipan fragmen DNA asing, maka EcoR I tidak dapat digunakan untuk memotong pBR322 di tempat penyisipan tersebut. Namun, saat ini telah dikonstruksi derivat-derivat pBR322 yang mempunyai tempat pengenalan EcoR I di dalam marker, misalnya plasmid pBR324 dan pBR325 yang masing-masing mempunyai tempat pengenalan EcoR I di dalam gen struktural kolisin dan di dalam gen resisten kloramfenikol.

Gambar 11.1. Plasmid pBR322
ampR = marker resisten ampisilin
tetR = marker resisten tetrasiklin

Misalnya saja kita menyisipkan suatu fragmen DNA pada daerah marker resisten ampisilin dengan memotong daerah ini menggunakan enzim restriksi tertentu selain EcoR I (mengapa harus selain EcoR I?). Plasmid pBR322 yang tersisipi oleh fragmen DNA akan kehilangan sifat resistensinya terhadap ampisilin, tetapi masih mempunyai sifat resistensi terhadap tetrasiklin. Oleh karena itu, ketika plasmid pBR322 rekombinan ini dimasukkan ke dalam sel inangnya, yakni E. coli, bakteri transforman ini tidak mampu tumbuh pada medium yang mengandung ampisilin, tetapi tumbuh pada medium tetrasiklin. Secara alami E. coli tidak mampu tumbuh baik pada medium ampisilin maupun tetrasiklin sehingga sel transforman dapat dengan mudah dibedakan dengan sel nontransforman yang tidak mengandung pBR322 sama sekali. Sementara itu, E. coli transforman yang membawa plasmid pBR322 utuh (religasi) mampu tumbuh pada kedua medium antibiotik tersebut. Jadi, untuk memperoleh sel E. coli transforman yang membawa DNA rekombinan dicari koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini dilakukan menggunakan transfer koloni atau replica plating (lihat Bab X).
Plasmid yang digunakan pada bakteri gram negatif seperti halnya pBR322 tidak dapat digunakan pada bakteri gram positif. Namun, saat ini telah tersedia plasmid untuk kloning pada bakteri gram positif, misalnya pT127 dan pC194, yang dikonstruksi oleh S.D. Erlich pada tahun 1977 dari bakteri Staphylococcus aureus. Demikian juga, telah ditemukan plasmid untuk kloning pada eukariot, khususnya pada khamir, misalnya yeast integrating plasmids (YIps), yeast episomal plasmids (YEps), yeast replicating plasmids (YRps), dan yeast centromere plasmid (YCps).
Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning. Dua di antaranya akan dijelaskan berikut ini.

Bakteriofag l

Bakteriofag atau fag l merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika. DNA l yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA l untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.
Seluruh urutan basa DNA l telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh karena itu, DNA l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA l, yaitu
vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing, vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.
Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb. Salah satu contohnya adalah vektor WES, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial, yaitu gen W, E, dan S. Vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat menekan mutasi tersebut.
Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA l di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA asing. Jika pembuangan segmen DNA l tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNA asing, maka akan terjadi religasi vektor DNA l yang kehilangan sebagian segmen pada daerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.

Gambar 11.2. DNA bakteriofag l
konformasi linier (di luar sel inang)
konformasi sirkuler (di dalam sel inang)

Bakteriofag l mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai dengan masuknya DNA l yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami replikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA l sirkuler, masing-masing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel l baru yang akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA l akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang.
Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak (plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut.

Bakteriofag M13

Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. Berbeda dengan l yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur berupa filamen. Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinya pada sel inang berlangsung melalui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma.
Ketika berada di dalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan. Salinan-salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13 terselubungi dengan cara pembentukan kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. Inilah salah satu keuntungan penggunaan M13 sebagai vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l. Keuntungan lainnya adalah bahwa M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutan basa) DNA dan mutagenesis tapak terarah (site directed mutagenesis) karena untai tunggal DNA M13 dapat dijadikan cetakan (templat) di dalam kedua proses tersebut.
Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk mengatasi masalah tersebut.

Kosmid

Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA l dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid.

Fasmid

Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakan gabungan antara plasmid dan fag l. Vektor yang dinamakan fasmid ini membawa segmen DNA l yang berisi tempat att. Tempat att digunakan oleh DNA l untuk berintegrasi dengan kromosom sel inang pada fase lisogenik.

Vektor YACs

Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomes atau kromosom buatan dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakan terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik awal replikasi.
YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Proyek Genom Manusia.

Vektor YEps

Vektor-vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi gen pada Saccharomyces cerevisiae dirancang atas dasar plasmid alami berukuran 2 μm, yang selanjutnya dikenal dengan nama plasmid 2 mikron. Plasmid ini memiliki sekuens DNA sepanjang 6 kb, yang mencakup titik awal replikasi dan dua gen yang terlibat dalam replikasi.
Vektor-vektor yang dirancang atas dasar plasmid 2 mikron disebut YEps (yeast episomal plasmids). Segmen plasmid 2 mikronnya membawa titik awal replikasi, sedangkan segmen kromosom khamirnya membawa suatu gen yang berfungsi sebagai penanda seleksi, misalnya gen LEU2 yang terlibat dalam biosintesis leusin. Meskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid pada umumnya, YEps dapat terintegrasi ke dalam kromosom khamir inangnya.

Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens

Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut plasmid Ti (tumor inducing atau penyebab tumor). Bakteri A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya padi. Ketika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid Ti, yang disebut T-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya, akan terbentuk tumor atau crown gall.
Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini selanjutnya akan dieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman.
Dalam prakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun, ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi dengan DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel bakteri A. tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E.coli. Selanjutnya, plasmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel A. tumefaciens yang membawa plasmid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.

Baculovirus

Baculovirus merupakan virus yang menginfeksi serangga. Salah satu protein penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang akan terakumulasi dalam jumlah sangat besar di dalam nuklei sel-sel serangga yang diinfeksi karena gen tersebut mempunyai promoter yang sangat aktif. Promoter ini dapat digunakan untuk memacu overekspresi gen-gen asing yang diklon ke dalam genom bacilovirus sehingga akan diperoleh produk protein yang sangat banyak jumlahnya di dalam kultur sel-sel serangga yang terinfeksi.

Vektor Kloning pada Mamalia

Vektor untuk melakukan kloning pada sel-sel mamalia juga dikonstruksi atas dasar genom virus. Salah satu di antaranya yang telah cukup lama dikenal adalah SV40, yang menginfeksi berbagai spesies mamalia. Genom SV40 panjangnya hanya 5,2 kb. Genom ini mengalami kesulitan dalam pengepakan (packaging) sehingga pemanfaatan SV40 untuk mentransfer fragmen–fragmen berukuran besar menjadi terbatas.
Retrovirus mempunyai genom berupa RNA untai tunggal yang ditranskripsi balik menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi. DNA ini kemudian terintegrasi dengan stabil ke dalam genom sel mamalia inang sehingga retrovirus telah digunakan sebagai vektor dalam terapi gen. Retrovirus mempunyai beberapa promoter yang kuat.

Pengaturan Ekspresi Gen

2009-01-21T02:38:00.000+07:00

Mekanisme Pengaturan Ekspresi Gen

Produk-produk gen tertentu seperti protein ribosomal, rRNA, tRNA, RNA polimerase, dan enzim-enzim yang mengatalisis berbagai reaksi metabolisme yang berkaitan dengan fungsi pemeliharaan sel merupakan komponen esensial bagi semua sel. Gen-gen yang menyandi pembentukan produk semacam itu perlu diekspresikan terus-menerus sepanjang umur individu di hampir semua jenis sel tanpa bergantung kepada kondisi lingkungan di sekitarnya. Sementara itu, banyak pula gen lainnya yang ekspresinya sangat ditentukan oleh kondisi lingkungan sehingga mereka hanya akan diekspresikan pada waktu dan di dalam jenis sel tertentu. Untuk gen-gen semacam ini harus ada mekanisme pengaturan ekspresinya.

Pengaturan ekspresi gen dapat terjadi pada berbagai tahap, misalnya transkripsi, prosesing mRNA, atau translasi. Namun, sejumlah data hasil penelitian menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen, khususnya pada prokariot, paling banyak terjadi pada tahap transkripsi.

Mekanisme pengaturan transkripsi, baik pada prokariot maupun pada eukariot, secara garis besar dapat dibedakan menjadi dua kategori utama, yaitu (1) mekanisme yang melibatkan penyalapadaman (turn on and turn off) ekspresi gen sebagai respon terhadap perubahan kondisi lingkungan dan (2) sirkit ekspresi gen yang telah terprogram (preprogramed circuits). Mekanisme penyalapadaman sangat penting bagi mikroorganisme untuk menyesuaikan diri terhadap perubahan lingkungan yang seringkali terjadi secara tiba-tiba. Sebaliknya, bagi eukariot mekanisme ini nampaknya tidak terlalu penting karena pada organisme ini sel justru cenderung merespon sinyal-sinyal yang datang dari dalam tubuh, dan di sisi lain, sistem sirkulasi akan menjadi penyangga bagi sel terhadap perubahan kondisi lingkungan yang mendadak tersebut. Pada mekanisme sirkit, produk suatu gen akan menekan transkripsi gen itu sendiri dan sekaligus memacu transkripsi gen kedua, produk gen kedua akan menekan transkripsi gen kedua dan memacu transkripsi gen ketiga, demikian seterusnya. Ekspresi gen yang berurutan ini telah terprogram secara genetik sehingga gen-gen tersebut tidak akan dapat diekspresikan di luar urutan. Oleh karena urutan ekspresinya berupa sirkit, maka mekanisme tersebut dinamakan sirkit ekspresi gen.

...

Induksi dan Represi pada Prokariot

Escherichia coli merupakan bakteri yang sering dijadikan model untuk mempelajari berbagai mekanisme genetika molekuler. Bakteri ini secara alami hidup di dalam usus besar manusia dengan memanfaatkan sumber karbon yang umumnya berupa glukosa. Apabila suatu ketika E. coli ditumbuhkan pada medium yang sumber karbonnya bukan glukosa melainkan laktosa, maka enzim pemecah laktosa akan disintesis, sesuatu yang tidak biasa dilakukannya. Untuk itu, gen-gen penyandi berbagai enzim yang terlibat dalam pemanfaatan laktosa akan diekspresikan (turned on). Sebaliknya, dalam keadaan normal, yaitu ketika tersedia glukosa sebagai sumber karbon, maka gen-gen tersebut tidak diekspresikan (turned off). Proses yang terjadi ketika ekspresi gen merupakan respon terhadap keberadaan suatu zat di lingkungannya dikenal sebagai induksi, sedangkan zat atau molekul yang menyebabkan terjadinya induksi disebut sebagai induser. Jadi, dalam contoh ini laktosa merupakan induser.

Induksi secara molekuler terjadi pada tingkat transkripsi. Peristiwa ini berkenaan dengan laju sintesis enzim, bukan dengan aktivitas enzim. Pada pengaktifan enzim suatu molekul kecil akan terikat pada enzim sehingga akan terjadi peningkatan aktivitas enzim tersebut, bukan peningkatan laju sintesisnya.

Selain mempunyai kemampuan untuk memecah suatu molekul (katabolisme), bakteri juga dapat menyintesis (anabolisme) berbagai molekul organik yang diperlukan bagi pertumbuhannya. Sebagai contoh, Salmonella typhimurium mempunyai sejumlah gen yang menyandi enzim-enzim untuk biosintesis triptofan. Dalam medium pertumbuhan yang tidak mengandung triptofan, S. typhimurium akan mengekspresikan (turned on) gen-gen tersebut. Akan tetapi, jika suatu saat ke dalam medium pertumbuhannya ditambahkan triptofan, maka gen-gen tersebut tidak perlu diekspresikan (turned off). Proses pemadaman (turn off) ekspresi gen sebagai respon terhadap keberadaan suatu zat di lingkungannya dinamakan represi, sedangkan zat yang menyebabkan terjadinya represi disebut sebagai korepresor. Jadi, dalam contoh ini triptofan merupakan korepresor.

Seperti halnya induksi, represi juga terjadi pada tahap transkripsi. Represi sering dikacaukan dengan inhibisi umpan balik (feedback inhibition), yaitu penghambatan aktivitas enzim akibat pengikatan produk akhir reaksi yang dikatalisis oleh enzim itu sendiri. Represi tidak menghambat aktivitas enzim, tetapi menekan laju sintesisnya.

Model operon

Mekanisme molekuler induksi dan represi telah dapat dijelaskan menurut model yang diajukan oleh F. Jacob dan J. Monod pada tahun 1961. Menurut model yang dikenal sebagai operon ini ada dua unsur yang mengatur transkripsi gen struktural penyandi enzim, yaitu gen regulator (gen represor) dan operator yang letaknya berdekatan dengan gen-gen struktural yang diaturnya. Gen regulator menyandi pembentukan suatu protein yang dinamakan represor. Pada kondisi tertentu represor akan berikatan dengan operator, menyebabkan terhalangnya transkripsi gen-gen struktural. Hal ini terjadi karena enzim RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter yang letaknya berdekatan, atau bahkan tumpang tindih, dengan operator.

Secara keseluruhan setiap operon terdiri atas promoter operon atau promoter bagi gen-gen struktural (PO), operator (O), dan gen-gen struktural (GS). Di luar operon terdapat gen regulator (R) beserta promoternya (PR), molekul protein represor yang dihasilkan oleh gen regulator, dan molekul efektor. Molekul efektor pada induksi adalah induser, sedangkan pada represi adalah korepresor.

Gambar 7.1. Model operon untuk pengaturan ekspresi gen

a) komponen operon b) induksi c) represi

Pada Gambar 7.1 terlihat bahwa terikatnya represor pada operator terjadi dalam keadaan yang berkebalikan antara induksi dan represi. Pada induksi represor secara normal akan berikatan dengan operator sehingga RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter operon. Akibatnya, transkripsi gen-gen struktural tidak dapat berlangsung. Namun, dengan terikatnya represor oleh induser, promoter operon menjadi terbuka bagi RNA polimerase sehingga gen-gen struktural dapat ditranskripsi dan selanjutnya ditranslasi. Dengan demikian, gen-gen struktural akan diekspresikan apabila terdapat molekul induser yang mengikat represor.

Operon yang terdiri atas gen-gen yang ekspresinya terinduksi dinamakan operon induksi. Salah satu contohnya adalah operon lac, yang terdiri atas gen-gen penyandi enzim pemecah laktosa seperti telah disebutkan di atas.

Sebaliknya, pada represi secara normal represor tidak berikatan dengan operator sehingga RNA polimerase dapat memasuki promoter operon dan transkripsi gen-gen struktural dapat terjadi. Akan tetapi, dengan adanya korepresor, akan terbentuk kompleks represor-korepresor yang kemudian berikatan dengan operator. Dengan pengikatan ini, RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter operon sehingga transkripsi gen-gen struktural menjadi terhalang. Jadi, ekspresi gen-gen struktural akan terepresi apabila terdapat molekul korepresor yang berikatan dengan represor.

Gen-gen yang ekspresinya dapat terepresi merupakan komponen operon yang dinamakan operon represi. Operon trp, yang terdiri atas gen-gen penyandi enzim untuk biosintesis triptofan merupakan contoh operon represi.

Pengaturan Ekspresi Gen pada Eukariot

Hingga sekarang kita baru sedikit sekali mengetahui mekanisme pengaturan ekspresi gen pada eukariot. Namun, kita telah mengetahui bahwa pada eukariot tingkat tinggi gen-gen yang berbeda akan ditranskripsi pada jenis sel yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme pengaturan pada tahap transkripsi, dan juga prosesing mRNA, memegang peran yang sangat penting dalam proses diferensiasi sel.

Operon, kalau pun ada, nampaknya tidak begitu penting pada eukariot. Hanya pada eukariot tingkat rendah seperti jamur dapat ditemukan satuan-satuan operon atau mirip operon. Semua mRNA pada eukariot tingkat tinggi adalah monosistronik, yaitu hanya membawa urutan sebuah gen struktural. Transkrip primer yang adakalanya menyerupai polisistronik pun akan diproses menjadi mRNA yang monosistronik.

Selain itu, terindikasi juga bahwa diferensiasi sel sedikit banyak melibatkan ekspresi seperangkat gen yang telah terprogram (preprogramed). Berbagai macam sinyal seperti molekul-molekul sitoplasmik, hormon, dan rangsangan dari lingkungan memicu dimulainya pembacaan program-program dengan urutan tertentu pada waktu dan tempat yang tepat selama perkembangan individu. Bukti paling nyata mengenai adanya keharusan urutan pembacaan program pada waktu dan tempat tertentu dapat dilihat pada kasus mutasi yang terjadi pada lalat Drosophila, misalnya munculnya sayap di kepala di tempat yang seharusnya untuk mata. Dengan mempelajari mutasi-mutasi semacam ini diharapkan akan diperoleh pengetahuan tentang mekanisme pengaturan ekspresi gen selama perkembangan normal individu.

Pada eukariot tingkat tinggi kurang dari 10 persen gen yang terdapat di dalam seluruh genom akan terepresentasikan urutan basanya di antara populasi mRNA yang telah mengalami prosesing. Sebagai contoh, hanya ada dua hingga lima persen urutan DNA mencit yang akan terepresentasikan pada mRNA di dalam sel-sel hatinya. Demikian pula, mRNA di dalam sel-sel otak katak Xenopus hanya merepresentasikan delapan persen urutan DNAnya. Jadi, sebagian besar urutan basa DNA di dalam genom eukariot tingkat tinggi tidak terepresentasikan di antara populasi mRNA yang ada di dalam sel atau jaringan tertentu. Dengan perkataan lain, molekul mRNA yang dihasilkan dari perangkat gen yang berbeda akan dijumpai di dalam sel atau jaringan yang berbeda pula.

Dosis gen dan amplifikasi gen

Kebutuhan akan produk-produk gen pada eukariot dapat sangat bervariasi. Beberapa produk gen dibutuhkan dalam jumlah yang jauh lebih besar daripada produk gen lainnya sehingga terdapat nisbah kebutuhan di antara produk-produk gen yang berbeda. Untuk memenuhi nisbah kebutuhan ini antara lain dapat ditempuh melalui dosis gen. Katakanlah, ada gen A dan gen B yang ditranskripsi dan ditranslasi dengan efisiensi yang sama. Produk gen A dapat 20 kali lebih banyak daripada produk gen B apabila terdapat 20 salinan (kopi) gen A untuk setiap salinan gen B. Contoh yang nyata dapat dilihat pada gen-gen penyandi histon. Untuk menyintesis histon dalam jumlah besar yang dibutuhkan dalam pembentukan kromatin, kebanyakan sel mempunyai beratus-ratus kali salinan gen histon daripada jumlah salinan gen yang diperlukan untuk replikasi DNA.

Salah satu pengaruh dosis gen adalah amplifikasi gen, yaitu peningkatan jumlah gen sebagai respon terhadap sinyal tertentu. Sebagai contoh, amplifikasi gen terjadi selama perkembangan oosit katak Xenopus laevis. Pembentukan oosit dari prekursornya (oogonium) merupakan proses kompleks yang membutuhkan sejumlah besar sintesis protein. Untuk itu dibutuhkan sejumlah besar ribosom. Kita mengetahui bahwa ribosom antara lain terdiri atas molekul-molekul rRNA. Padahal, sel-sel prekursor tidak mempunyai gen penyandi rRNA dalam jumlah yang mencukupi untuk sintesis molekul tersebut dalam waktu yang relatif singkat. Namun, sejalan dengan perkembangan oosit terjadi peningkatan jumlah gen rRNA hingga 4000 kali sehingga dari sebanyak 600 gen yang ada pada prekursor akan diperoleh sekitar dua juta gen setelah amplifikasi. Jika sebelum amplifikasi ke-600 gen rRNA berada di dalam satu segmen DNA linier, maka selama dan setelah amplifikasi gen tersebut akan berada di dalam gulungan-gulungan kecil yang mengalami replikasi. Molekul rRNA tidak diperlukan lagi ketika oosit telah matang hingga saat terjadinya fertilisasi. Oleh karena itu, gen rRNA yang telah begitu banyak disalin kemudian didegradasi kembali oleh berbagai enzim intrasel.

Jika waktu yang tersedia untuk melakukan sintesis sejumlah besar protein cukup banyak, amplifikasi gen sebenarnya tidak perlu dilakukan. Cara lain untuk mengatasi kebutuhan protein tersebut adalah dengan meningkatkan masa hidup mRNA (lihat bagian pengaturan translasi).

Pengaturan transkripsi

Berdasarkan atas banyaknya salinan di dalam tiap sel, molekul mRNA dapat dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu (1) mRNA salinan tunggal (single copy), (2) mRNA semiprevalen dengan jumlah salinan lebih dari satu hingga beberapa ratus per sel, dan (3) mRNA superprevalen dengan jumlah salinan beberapa ratus hingga beberapa ribu per sel. Molekul mRNA salinan tunggal dan semiprevalen masing-masing menyandi enzim dan protein struktural. Sementara itu, mRNA superprevalen biasanya dihasilkan sejalan dengan terjadinya perubahan di dalam suatu tahap perkembangan organisme eukariot. Sebagai contoh, sel-sel eritroblas di dalam sumsum tulang belakang mempunyai sejumlah besar mRNA yang dapat ditranslasi menjadi globin matang. Di sisi lain, hanya sedikit sekali atau bahkan tidak ada globin yang dihasilkan oleh sel-sel prekursor yang belum berkembang menjadi eritroblas. Dengan demikian, kita dapat memastikan adanya suatu mekanisme pengaturan ekspresi gen penyandi mRNA superprevalen pada tahap transkripsi eukariot meskipun hingga kini belum terlalu banyak rincian prosesnya yang dapat diungkapkan.

Salah satu regulator yang diketahui berperan dalam transkripsi eukariot adalah hormon, molekul protein kecil yang dibawa dari sel tertentu menuju ke sel target. Mekanisme kerja hormon dalam mengatur transkripsi eukariot lebih kurang dapat disetarakan dengan induksi pada prokariot. Namun, penetrasi hormon ke dalam sel target dan pengangkutannya ke dalam nukleus merupakan proses yang jauh lebih rumit bila dibandingkan dengan induksi oleh laktosa pada E. coli.

Secara garis besar pengaturan transkripsi oleh hormon dimulai dengan masuknya hormon ke dalam sel target melewati membran sel, yang kemudian ditangkap oleh reseptor khusus yang terdapat di dalam sitoplasma sehingga terbentuk kompleks hormon-reseptor. Setelah kompleks ini terbentuk biasanya reseptor akan mengalami modifikasi struktur kimia. Kompleks hormon-reseptor yang termodifikasi kemudian menembus dinding nukleus untuk memasuki nukleus. Proses selanjutnya belum banyak diketahui, tetapi rupanya di dalam nukleus kompleks tersebut, atau mungkin hormonnya saja, akan mengalami salah satu di antara beberapa peristiwa, yaitu (1) pengikatan langsung pada DNA, (2) pengikatan pada suatu protein efektor, (3) aktivasi protein yang terikat DNA, (4) inaktivasi represor, dan (5) perubahan struktur kromatin agar DNA terbuka bagi enzim RNA polimerase.

Contoh induksi transkripsi oleh hormon antara lain dapat dilihat pada stimulasi sintesis ovalbumin pada saluran telur (oviduktus) ayam oleh hormon kelamin estrogen. Jika ayam disuntik dengan estrogen, jaringan-jaringan oviduktus akan memberikan respon berupa sintesis mRNA untuk ovalbumin. Sintesis ini akan terus berlanjut selama estrogen diberikan, dan hanya sel-sel oviduktus yang akan menyintesis mRNA tersebut. Hal ini karena sel-sel atau jaringan lainnya tidak mempunyai reseptor hormon estrogen di dalam sitoplasmanya.

Pengaturan pada tahap prosesing mRNA

Dua jenis sel yang berbeda dapat membuat protein yang sama tetapi dalam jumlah yang berbeda meskipun transkripsi di dalam kedua sel tersebut terjadi pada gen yang sama. Fenomena ini seringkali berkaitan dengan adanya molekul-molekul mRNA yang berbeda, yang akan ditranslasi dengan efisiensi berbeda pula.

Pada tikus, misalnya, ditemukan bahwa perbedaan sintesis enzim α-amilase oleh berbagai mRNA yang berasal dari gen yang sama dapat terjadi karena adanya perbedaan pola pembuangan intron. Kelenjar ludah menghasilkan α-amilase lebih banyak daripada yang dihasilkan oleh jaringan hati meskipun gen yang ditranskripsi sama. Jadi, dalam hal ini transkrip primernya sebenarnya sama, tetapi kemudian ada perbedaan mekanisme prosesing, khususnya pada penyatuan (splicing) mRNA.

Pengaturan translasi

Berbeda dengan translasi mRNA pada prokariot yang terjadi dalam jumlah yang lebih kurang sama, pada eukariot ada mekanisme pengaturan translasi. Macam-macam pengaturan tersebut adalah (1) kondisi bahwa mRNA tidak akan ditranslasi sama sekali sebelum datangnya suatu sinyal, (2) pengaturan umur (lifetime) molekul mRNA, dan (3) pengaturan laju seluruh sintesis protein.

Telur yang tidak dibuahi secara biologi bersifat statis. Akan tetapi, begitu fertilisasi terjadi, sejumlah protein akan disintesis. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam sel telur yang belum dibuahi akan dijumpai sejumlah mRNA yang menantikan datangnya sinyal untuk translasi. Sinyal tersebut tidak lain adalah fertilisasi oleh spermatozoon, sedangkan molekul mRNA yang belum ditranslasi itu dinamakan mRNA tersembunyi (masked mRNA).

Pengaturan umur mRNA juga dijumpai pada telur yang belum dibuahi. Sel telur ini akan mempertahankan diri untuk tidak mengalami pertumbuhan atau perkembangan. Dengan demikian, laju sintesis protein menjadi sangat rendah. Namun, hal ini bukan akibat kurangnya pasokan mRNA, melainkan karena terbatasnya ketersediaan suatu unsur yang dinamakan faktor rekrutmen. Hingga kini belum diketahui hakekat unsur tersebut, tetapi rupanya berperan dalam pembentukan kompleks ribosom-mRNA.

Sintesis beberapa protein tertentu diatur oleh aktivitas protein itu sendiri terhadap mRNA. Sebagai contoh, konsentrasi suatu jenis molekul antibodi dipertahankan konstan oleh mekanisme inhibisi atau penghambatan diri dalam proses translasi. Jadi, molekul antibodi tersebut berikatan secara khusus dengan molekul mRNA yang menyandinya sehingga inisiasi translasi akan terhambat.

Sintesis beberapa protein dari satu segmen DNA

Pada prokariot terdapat mRNA polisistronik yang menyandi semua produk gen. Sebaliknya, pada eukariot tidak pernah dijumpai mRNA polisistronik, tetapi ada kondisi yang dapat disetarakan dengannya, yakni sintesis poliprotein. Poliprotein adalah polipeptida berukuran besar yang setelah berakhirnya translasi akan terpotong-potong untuk menghasilkan sejumlah molekul protein yang utuh. Tiap protein ini dapat dilihat sebagai produk satu gen tunggal. Dalam sistem semacam itu urutan penyandi pada masing-masing gen tidak saling dipisahkan oleh kodon stop dan kodon awal, tetapi dipisahkan oleh urutan asam amino tertentu yang dikenal sebagai tempat pemotongan (cleavage sites) oleh enzim protease tertentu. Tempat-tempat pemotongan ini tidak akan berfungsi serempak, tetapi bergantian mengikuti suatu urutan.

Translasi

2009-01-21T02:35:00.000+07:00

Prosesing RNA

Bila dibandingkan dengan transkripsi, translasi merupakan proses yang lebih rumit karena melibatkan fungsi berbagai makromolekul. Oleh karena kebanyakan di antara makromolekul ini terdapat dalam jumlah besar di dalam sel, maka sistem translasi menjadi bagian utama mesin metabolisme pada tiap sel. Makromolekul yang harus berperan dalam proses translasi tersebut meliputi

Lebih dari 50 polipeptida serta 3 hingga 5 molekul RNA di dalam tiap ribosom

Sekurang-kurangnya 20 macam enzim aminoasil-tRNA sintetase yang akan mengaktifkan asam amino

Empat puluh hingga 60 molekul tRNA yang berbeda

Sedikitnya 9 protein terlarut yang terlibat dalam inisiasi, elongasi, dan terminasi polipeptida.

...

Ribosom

Translasi, atau pada hakekatnya sintesis protein, berlangsung di dalam ribosom, suatu struktur organel yang banyak terdapat di dalam sitoplasma. Ribosom terdiri atas dua subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu selama inisiasi translasi dan terpisah ketika translasi telah selesai. Ukuran ribosom sering dinyatakan atas dasar laju pengendapannya selama sentrifugasi sebagai satuan yang disebut satuan Svedberg (S). Pada kebanyakan prokariot ribosom mempunyai ukuran 70S, sedangkan pada eukariot biasanya sekitar 80S.

Tiap ribosom mempunyai dua tempat pengikatan tRNA, yang masing-masing dinamakan tapak aminoasil (tapak A) dan tapak peptidil (tapak P). Molekul aminoasil-tRNA yang baru memasuki ribosom akan terikat di tapak A, sedangkan molekul tRNA yang membawa rantai polipeptida yang sedang diperpanjang terikat di tapak P.

Gambaran penting sintesis protein adalah bahwa proses ini berlangsung dengan arah tertentu sebagai berikut.

Molekul mRNA ditranslasi dengan arah 5’→ 3’, tetapi tidak dari ujung 5’ hingga ujung 3’.

Polipeptida disintesis dari ujung amino ke ujung karboksil dengan menambahkan asam-asam amino satu demi satu ke ujung karboksil. Sebagai contoh, sintesis protein yang mempunyai urutan NH2-Met-Pro- . . . -Gly-Ser-COOH pasti dimulai dengan metionin dan diakhiri dengan serin.

Proses Translasi

Mekanisme translasi atau sintesis protein secara skema garis besar dapat dilihat pada Gambar 6.1. Sebuah molekul mRNA akan terikat pada permukaan ribosom yang kedua subunitnya telah bergabung. Pengikatan ini terjadi karena pada mRNA prokariot terdapat urutan basa tertentu yang disebut sebagai tempat pengikatan ribosom (ribosom binding site) atau urutan Shine-Dalgarno. Sementara itu, pada eukariot pengikatan ribosom dilakukan oleh ujung 5’ mRNA. Selanjutnya, berbagai aminoasil-tRNA akan berdatangan satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA ini dengan urutan sesuai dengan antikodon dan asam amino yang dibawanya. Urutan ini ditentukan oleh urutan triplet kodon pada mRNA. Ikatan peptida terbentuk di antara asam-asam amino yang terangkai menjadi rantai polipeptida di tapak P ribosom. Penggabungan asam-asam amino terjadi karena gugus amino pada asam amino yang baru masuk berikatan dengan gugus karboksil pada asam amino yang terdapat pada rantai polipeptida yang sedang diperpanjang. Penjelasan tentang mekanisme sintesis protein yang lebih rinci disertai contoh, khususnya pada prokariot, akan diberikan di bawah ini

Gambar 6.1. Skema garis besar sintesis protein

Inisiasi sintesis protein dilakukan oleh aminoasil-tRNA khusus, yaitu tRNA yang membawa metionin (dilambangkan sebagai metionil-tRNAiMet). Hal ini berarti bahwa sintesis semua polipeptida selalu dimulai dengan metionin. Khusus pada prokariot akan terjadi formilasi gugus amino pada metionil-tRNAiMet (dilambangkan sebagai metionil-tRNAfMet) yang mencegah terbentuknya ikatan peptida antara gugus amin tersebut dengan gugus karboksil asam amino pada ujung polipetida yang sedang diperpanjang sehingga asam amino awal pada polipeptida prokariot selalu berupa f-metionin. Pada eukariot metionil-tRNAiMet tidak mengalami formilasi gugus amin, tetapi molekul ini akan bereaksi dengan protein-protein tertentu yang berfungsi sebagai faktor inisiasi (IF-1, IF-2, dan IF-3). Selain itu, baik pada prokariot maupun eukariot, terdapat pula metionil-tRNA yang metioninnya bukan merupakan asam amino awal (dilambangkan sebagai metionil-tRNAMet).

Kompleks inisiasi pada prokariot terbentuk antara mRNA, metionil-tRNAfMet, dan subunit kecil ribosom (30S) dengan bantuan protein IF-1, IF-2, dan IF-3, serta sebuah molekul GTP. Pembentukan kompleks inisiasi ini diduga difasilitasi oleh perpasangan basa antara suatu urutan di dekat ujung 3’ rRNA berukuran 16S dan sebagian urutan pengarah (leader sequence) pada mRNA. Selanjutnya, kompleks inisiasi bergabung dengan subunit besar ribosom (50S), dan metionil-tRNAfMet terikat pada tapak P. Berpasangannya triplet kodon inisiasi pada mRNA dengan antikodon pada metionil-tRNAfMet di tapak P menentukan urutan triplet kodon dan aminoasil-tRNAfMet berikutnya yang akan masuk ke tapak A. Pengikatan aminoasil-tRNAfMet berikutnya, misalnya alanil- tRNAala, ke tapak A memerlukan protein-protein elongasi EF-Ts dan EF-Tu. Pembentukan ikatan peptida antara gugus karboksil pada metionil-tRNAfMet di tapak P dan gugus amino pada alanil-tRNAala di tapak A dikatalisis oleh enzim peptidil transferase, suatu enzim yang terikat pada subunit ribosom 50S. Reaksi ini menghasilkan dipeptida yang terdiri atas f-metionin dan alanin yang terikat pada tRNAala di tapak A.

Langkah berikutnya adalah translokasi, yang melibatkan (1) perpindahan f-met-ala- tRNAala dari tapak A ke tapak P dan (2) pergeseran posisi mRNA pada ribosom sepanjang tiga basa sehingga triplet kodon yang semula berada di tapak A masuk ke tapak P. Dalam contoh ini triplet kodon yang bergeser dari tapak A ke P tersebut adalah triplet kodon untuk alanin. Triplet kodon berikutnya, misalnya penyandi serin, akan masuk ke tapak A dan proses seperti di atas hingga translokasi akan terulang kembali. Translokasi memerlukan aktivitas faktor elongasi berupa enzim yang biasa dilambangkan dengan EF-G.

Pemanjangan atau elongasi rantai polipeptida akan terus berlangsung hingga suatu tripet kodon yang menyandi terminasi memasuki tapak A. Sebelum suatu rantai polipeptida selesai disintesis terlebih dahulu terjadi deformilisasi pada f-metionin menjadi metionin. Terminasi ditandai oleh terlepasnya mRNA, tRNA di tapak P, dan rantai polipeptida dari ribosom. Selain itu, kedua subunit ribosom pun memisah. Pada terminasi diperlukan aktivitas dua protein yang berperan sebagai faktor pelepas atau releasing factors, yaitu RF-1 dan RF-2.

Sesungguhnya setiap mRNA tidak hanya ditranslasi oleh sebuah ribosom. Pada umumnya sebuah mRNA akan ditranslasi secara serempak oleh beberapa ribosom yang satu sama lain berjarak sekitar 90 basa di sepanjang molekul mRNA. Kompleks translasi yang terdiri atas sebuah mRNA dan beberapa ribosom ini dinamakan poliribosom atau polisom. Besarnya polisom sangat bervariasi dan berkorelasi dengan ukuran polipeptida yang akan disintesis. Sebagai contoh, rantai hemoglobin yang tersusun dari sekitar 150 asam amino disintesis oleh polisom yang terdiri atas lima buah ribosom (pentaribosom).

Pada prokariot translasi seringkali dimulai sebelum transkripsi berakhir. Hal ini dimungkinkan terjadi karena tidak adanya dinding nukleus yang memisahkan antara transkripsi dan translasi. Dengan berlangsungnya kedua proses tersebut secara bersamaan, ekspresi gen menjadi sangat cepat dan mekanisme nyala-padam (turn on-turn off) ekspresi gen, seperti yang akan dijelaskan nanti, juga menjadi sangat efisien.

Namun, tidak demikian halnya pada eukariot. Transkripsi terjadi di dalam nukleus, sedangkan translasi terjadi di sitoplasma (ribosom). Pertanyaan yang muncul adalah bagaimana mRNA hasil transkripsi dipindahkan dari nukleus ke sitoplasma, faktor-faktor apa yang menentukan saat dan tempat translasi? Sayangnya, hingga kini kita belum dapat menjawab pertanyaan-pertanyaan tersebut dengan memuaskan. Kita baru mengetahui bahwa transkripsi dan translasi pada eukariot jauh lebih rumit daripada proses yang ada pada prokariot. Salah satu di antaranya seperti telah kita bicarakan di atas, yaitu bahwa mRNA hasil transkripsi (transkrip primer) pada eukariot memerlukan prosesing terlebih dahulu sebelum dapat ditranslasi.

Kode Genetik

Penetapan triplet kodon pada mRNA sebagai pembawa informasi genetik atau kode genetik yang akan menyandi pembentukan suatu asam amino tertentu berawal dari pemikiran bahwa macam basa nitrogen jauh lebih sedikit daripada macam asam amino. Basa nitrogen pada mRNA hanya ada empat macam, sedangkan asam amino ada 20 macam. Oleh karena itu, jelas tidak mungkin tiap asam amino disandi oleh satu basa. Begitu juga, kombinasi dua basa hanya akan menghasilkan 42 atau 16 macam duplet, masih lebih sedikit daripada macam amino yang ada. Kombinasi tiga basa akan menghasilkan 43 atau 64 triplet, melebihi jumlah macam asam amino. Dalam hal ini, satu macam asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu macam triplet kodon.

Bukti bahwa kode genetik berupa triplet kodon diperoleh dari hasil penelitian F.H.C. Crick dan kawan-kawannya yang mempelajari mutasi pada lokus rIIB bakteriofag T4. Mutasi tersebut diinduksi oleh proflavin, suatu molekul yang dapat menyisip di sela-sela pasangan basa nitrogen sehingga kesalahan replikasi DNA dapat terjadi sewaktu-waktu, menghasilkan DNA yang kelebihan atau kekurangan satu pasangan basa. Hal ini akan menyebabkan perubahan rangka baca (reading frame), yaitu urutan pembacaan basa-basa nitrogen untuk diterjemahkan menjadi urutan asam amino tertentu. Mutasi yang disebabkan oleh perubahan rangka baca akibat kelebihan atau kekurangan pasangan basa disebut sebagai mutasi rangka baca (frameshift mutation) (lihat Bab VIII).

Jika mutan (hasil mutasi) rangka baca yang diinduksi oleh proflavin ditumbuhkan pada medium yang mengandung proflavin, akan diperoleh beberapa fag tipe liar sehingga mutasi seolah-olah dapat dipulihkan atau terjadi mutasi balik (reverse mutation). Pada awalnya mutasi balik diduga karena kelebihan pasangan basa dibuang dari rangka baca yang salah sehingga rangka baca tersebut telah diperbaiki menjadi seperti semula. Namun, karena mutasi bersifat acak, maka mekanisme semacam itu kecil sekali kemungkinannya untuk terjadi dan dugaan tersebut nampaknya tidak benar. Crick dan kawan-kawannya menjelaskan bahwa mutasi balik disebabkan oleh hilangnya (delesi) satu pasangan basa lain yang letaknya tidak terlalu jauh dari pasangan basa yang menyisip (adisi). Rangka baca yang baru ini akan menghasilkan urutan asam amino yang masih sama fungsinya dengan urutan sebelum terjadi mutasi. Dengan perkataan lain, mutasi balik terjadi karena efek mutasi awal akibat penambahan basa ditekan oleh mutasi kedua akibat pengurangan basa sehingga mutasi yang kedua ini disebut juga sebagai mutasi penekan (suppressor mutation).

Tabel 6.1. Kode genetik

Protein rIIB pada T4 mempunyai bagian-bagian yang di dalamnya dapat terjadi perubahan urutan asam amino. Perubahan ini dapat berpengaruh atau tidak berpengaruh terhadap fungsi proteinnya. Jika dua strain mutan T4 yang satu sama lain mengalami mutasi berbeda di dalam bagian protein rIIB disilangkan melalui infeksi campuran pada suatu inang, maka T4 tipe liar akan diperoleh sebagai hasil rekombinasi genetik antara kedua tempat mutasi yang berbeda itu. Akan tetapi, ketika kedua strain mutan rIIB yang disilangkan merupakan strain-strain yang diseleksi secara acak (tidak harus mengalami mutasi yang berbeda), ternyata tidak selalu diperoleh tipe liar. Hasil ini menunjukkan bahwa strain-strain mutan dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu strain + dan strain -. Dalam hal ini, strain + tidak harus selalu mutan adisi, dan strain – tidak harus selalu mutan delesi. Namun, sekali kita menggunakan tanda + untuk mutan adisi berarti strain + adalah mutan adisi. Begitu pula sebaliknya, sekali kita gunakan tanda + untuk mutan delesi berarti strain + adalah mutan delesi.

Persilangan antara strain + dan strain – hanya menghasilkan rekombinasi berupa fenotipe tipe liar, sedangkan persilangan antara sesama + atau sesama – tidak pernah menghasilkan tipe liar. Hal ini karena persilangan sesama + atau sesama – akan menyebabkan adisi atau delesi ganda sehingga selalu menghasilkan fenotipe mutan. Sementara itu, persilangan antara starin + dan – akan menyebabkan terjadinya mutasi penekan (adisi ditekan oleh delesi atau delesi ditekan oleh adisi) atau hanya menghasilkan mutasi pada urutan asam amino yang tidak berpengaruh terhadap fungsi protein sehingga diperoleh fenotipe tipe liar.

Gambar 6.2. Mutasi penekan yang memulihkan rangka baca

Oleh karena persilangan sesama + atau sesama – tidak pernah menghasilkan tipe liar, kode genetik jelas tidak mungkin terdiri atas dua basa. Seandainya, kode genetik berupa duplet, maka akan terjadi pemulihan rangka baca hasil persilangan tersebut. Kenyataannya tidak demikian. Pemulihan rangka baca akibat mutasi penekan justru terjadi apabila persilangan dilakukan antara strain + dan strain -.

Apabila kode genetik berupa triplet, maka persilangan teoretis sesama + atau sesama – akan menghasilkan fenotipe mutan, sesuai dengan hasil kenyataannya. Namun, rekombinasi antara tiga + atau tiga - akan menghasilkan tipe liar. Hal ini memperlihatkan bahwa kode genetik terdiri atas tiga basa.

Gambar 6.3. Diagram persilangan mutan rIIB pada T4 yang memperlihatkan bahwa kode genetik berupa triplet kodon

a) Jika kode genetik berupa duplet, hasil persilangan teoretis tidak sesuai dengan kenyataan yang diperoleh.

b)Jika kode genetik berupa triplet, hasil persilangan teoretis sesuai dengan kenyataan yang diperoleh.

Sifat-sifat kode genetik

Kode genetik mempunyai sifat-sifat yang akan dijelaskan sebagai berikut.

1. Kode genetik bersifat universal. Artinya, kode genetik berlaku sama hampir di setiap spesies organisme.

2. Kode genetik bersifat degenerate atau redundant, yaitu bahwa satu macam asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Sebagai contoh, treonin dapat disandi oleh ACU, ACC, ACA, dan ACG. Sifat ini erat kaitannya dengan sifat wobble basa ketiga, yang artinya bahwa basa ketiga dapat berubah-ubah tanpa selalu disertai perubahan macam asam amino yang disandinya. Diketahuinya sifat wobble bermula dari penemuan basa inosin (I) sebagai basa pertama pada antikodon tRNAala ragi, yang ternyata dapat berpasangan dengan basa A, U, atau pun C. Dengan demikian, satu antikodon pada tRNA dapat mengenali lebih dari satu macam kodon pada mRNA.

3. Oleh karena tiap kodon terdiri atas tiga buah basa, maka tiap urutan basa mRNA, atau berarti juga DNA, mempunyai tiga rangka baca yang berbeda (open reading frame). Di samping itu, di dalam suatu segmen tertentu pada DNA dapat terjadi transkripsi dan translasi urutan basa dengan panjang yang berbeda. Dengan perkataan lain, suatu segmen DNA dapat terdiri atas lebih dari sebuah gen yang saling tumpang tindih (overlapping). Sebagai contoh, bakteriofag фX174 mempunyai sebuah untai tunggal DNA yang panjangnya lebih kurang hanya 5000 basa. Seandainya dari urutan basa ini hanya digunakan sebuah rangka baca, maka akan terdapat sekitar 1700 asam amino yang dapat disintesis. Kemudian, jika sebuah molekul protein rata-rata tersusun dari 400 asam amino, maka dari sekitar 1700 asam amino tersebut hanya akan terbentuk 4 hingga 5 buah molekul protein. Padahal kenyataannya, bakteriofag фX174 mempunyai 11 protein yang secara keseluruhan terdiri atas 2300 asam amino. Dengan demikian, jelaslah bahwa dari urutan basa DNA yang ada tidak hanya digunakan sebuah rangka baca, dan urutan basa yang diekspresikan (gen) dapat tumpang tindih satu sama lain

Transkripsi

2009-01-21T02:26:00.000+07:00

Prinsip Dasar Transkripsi

Pada Bab IV telah disebutkan bahwa fungsi dasar kedua yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat)nya.

...

Transkripsi mempunyai ciri-ciri kimiawi yang serupa dengan sintesis/replikasi DNA, yaitu

Adanya sumber basa nitrogen berupa nukleosida trifosfat. Bedanya dengan sumber basa untuk sintesis DNA hanyalah pada molekul gula pentosanya yang tidak berupa deoksiribosa tetapi ribosa dan tidak adanya basa timin tetapi digantikan oleh urasil. Jadi, keempat nukleosida trifosfat yang diperlukan adalah adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sitidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP).

Adanya untai molekul DNA sebagai cetakan. Dalam hal ini hanya salah satu di antara kedua untai DNA yang akan berfungsi sebagai cetakan bagi sintesis molekul RNA. Untai DNA ini mempunyai urutan basa yang komplementer dengan urutan basa RNA hasil transkripsinya, dan disebut sebagai pita antisens. Sementara itu, untai DNA pasangannya, yang mempunyai urutan basa sama dengan urutan basa RNA, disebut sebagai pita sens. Meskipun demikian, sebenarnya transkripsi pada umumnya tidak terjadi pada urutan basa di sepanjang salah satu untai DNA. Jadi, bisa saja urutan basa yang ditranskripsi terdapat berselang-seling di antara kedua untai DNA.

Sintesis berlangsung dengan arah 5’→ 3’ seperti halnya arah sintesis DNA.

Gugus 3’- OH pada suatu nukleotida bereaksi dengan gugus 5’- trifosfat pada nukleotida berikutnya menghasilkan ikatan fosofodiester dengan membebaskan dua atom pirofosfat anorganik (PPi). Reaksi ini jelas sama dengan reaksi polimerisasi DNA. Hanya saja enzim yang bekerja bukannya DNA polimerase, melainkan RNA polimerase. Perbedaan yang sangat nyata di antara kedua enzim ini terletak pada kemampuan enzim RNA polimerase untuk melakukan inisiasi sintesis RNA tanpa adanya molekul primer.

Secara garis besar transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Masing-masing tahap akan dijelaskan secara singkat sebagai berikut.

Pengenalan promoter

Agar molekul DNA dapat digunakan sebagai cetakan dalam sintesis RNA, kedua untainya harus dipisahkan satu sama lain di tempat-tempat terjadinya penambahan basa pada RNA. Selanjutnya, begitu penambahan basa selesai dilakukan, kedua untai DNA segera menyatu kembali. Pemisahan kedua untai DNA pertama kali terjadi di suatu tempat tertentu, yang merupakan tempat pengikatan enzim RNA polimerase di sisi 5’ (upstream) dari urutan basa penyandi (gen) yang akan ditranskripsi. Tempat ini dinamakan promoter.

Inisiasi

Setelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan terikat pada suatu tempat di dekat promoter, yang dinamakan tempat awal polimerisasi atau tapak inisiasi (initiation site). Tempat ini sering dinyatakan sebagai posisi +1 untuk gen yang akan ditranskripsi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan di tapak inisiasi dan sintesis RNA pun segera dimulai.

Elongasi

Pengikatan enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya pada untai DNA cetakan membentuk kompleks transkripsi. Selama sintesis RNA berlangsung kompleks transkripsi akan bergeser di sepanjang molekul DNA cetakan sehingga nukleotida demi nukleotida akan ditambahkan kepada untai RNA yang sedang diperpanjang pada ujung 3’ nya. Jadi, elongasi atau polimerisasi RNA berlangsung dari arah 5’ ke 3’, sementara RNA polimerasenya sendiri bergerak dari arah 3’ ke 5’ di sepanjang untai DNA cetakan.

Terminasi

Berakhirnya polimerisasi RNA ditandai oleh disosiasi kompleks transkripsi atau terlepasnya enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya dari untai DNA cetakan. Begitu pula halnya dengan molekul RNA hasil sintesis. Hal ini terjadi ketika RNA polimerase mencapai urutan basa tertentu yang disebut dengan terminator.

Terminasi transkripsi dapat terjadi oleh dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk batang dan kala (loop) seperti pada Gambar 5.1.

Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang berbeda-beda.

Transkripsi pada Prokariot

Telah dikatakan di atas bahwa transkripsi merupakan proses sintesis RNA yang dikatalisis oleh enzim RNA polimerase. Berikut ini akan diuraikan sekilas enzim RNA polimerase pada prokariot, khususnya pada bakteri E.coli, promoter s70, serta proses transkripsi pada organisme tersebut.

Gambar 5.1 Terminasi sintesis RNA menghasilkan ujung berbentuk batang dan kala

RNA polimerase E. coli

Enzim RNA polimerase pada E. coli sekurang-kurangnya terdiri atas lima subunit, yaitu alfa (a), beta (b), beta prima (b’), omega (w), dan sigma (s). Pada bentuk lengkapnya, atau disebut sebagai holoenzim, terdapat dua subunit a dan satu subunit untuk masing-masing subunit lainnya sehingga sering dituliskan dengan a2bb’ws. Holoenzim RNA polimerase diperlukan untuk inisiasi transkripsi. Namun, untuk elongasi transkripsi tidak diperlukan faktor s sehingga subunit ini dilepaskan dari kompleks transkripsi begitu inisiasi selesai. Sisanya, yakni a2bb’w, merupakan enzim inti (core enzyme) yang akan melanjutkan proses transkripsi.

Laju sintesis RNA oleh RNA polimerase E. coli dapat mencapai sekitar 40 nukleotida per detik pada suhu 37°C. Untuk aktivitasnya enzim ini memerlukan kofaktor Mg2+. Setiap berikatan dengan molekul DNA enzim RNA polimerase E. coli dapat mencakup daerah sepanjang lebih kurang 60pb.

Meskipun kebanyakan RNA polimerase seperti halnya yang terdapat pada E. coli mempunyai struktur multisubunit, hal itu bukanlah persyaratan yang mutlak. RNA polimerase pada bakteriofag T3 dan T7, misalnya, merupakan rantai polipeptida tunggal yang ukurannya jauh lebih kecil daripada RNA polimerase bakteri. Enzim tersebut dapat menyintesis RNA dengan cepat, yaitu sebanyak 200 nukleotida per detik pada suhu 37°C.

Subunit a

Dua subunit a yang identik terdapat pada RNA polimerase inti. Kedua-duanya disandi oleh gen rpoA. Ketika bakteriofag T4 menginfeksi E.coli, subunit a akan dimodifikasi melalui ribosilasi ADP suatu arginin. Hal ini berkaitan dengan berkurangnya afinitas pengikatan promoter sehingga subunit a diduga kuat memegang peranan dalam pengenalan promoter.

Subunit b

Seperti halnya subunit a, subunit b juga terdapat pada RNA polimerase inti. Subunit ini diduga sebagai pusat katalitik RNA polimerase, yang dibuktikan melalui hasil penelitian mengenai penghambatan transkripsi menggunakan antibiotik. Antibiotik rifampisin merupakan inhibitor potensial bagi RNA polimerase yang menghalangi inisiasi tetapi tidak mempengaruhi elongasi. Kelompok antibiotik ini tidak menghambat polimerase eukariot sehingga sering digunakan untuk mengatasi infeksi bakteri Gram positif dan tuberkulosis. Rifampisin telah dibuktikan berikatan dengan subunit b, dan mutasi-mutasi yang menyebabkan resistensi terhadap rifampisin telah dipetakan pada gen rpoB, yaitu gen yang menyandi subunit b. Selanjutnya, kelompok antibiotik yang lain, yakni streptolidigin, ternyata menghambat elongasi transkripsi, dan mutasi-mutasi yang menyebabkan resistesi terhadap antibiotik ini juga dipetakan pada gen rpoB. Kedua hasil penelitian tersebut mendukung pendapat bahwa subunit b diduga mempunyai dua domain yang bertanggung jawab terhadap inisiasi dan elongasi transkripsi.

Subunit b’

Subunit b’ juga terdapat pada RNA polimerase inti. Subunit yang disandi oleh gen rpoC ini mengikat dua ion Zn2+ yang diduga berpartisipasi dalam fungsi katalitik polimerase. Suatu polianion, yakni heparin, terbukti mengikat subunit b’. Heparin menghambat transkripsi secara in vitro dan juga berkompetisi dengan DNA dalam pengikatan RNA polimerase. Hal ini mendukung pendapat bahwa subunit b’ diduga bertanggung jawab terhadap pengikatan DNA cetakan.

Faktor s

Faktor s yang paling umum dijumpai pada E. coli adalah s70 (disebut demikian karena mempunyai berat molekul 70 kDa). Pengikatan faktor s pada RNA polimerase inti akan mengubah enzim tersebut menjadi holoenzim. Faktor s memegang peranan yang penting dalam pengenalan promoter tetapi tidak diperlukan untuk elongasi transkripsi. Kontribusi faktor s dalam pengenalan promoter adalah melalui penurunan afinitas enzim inti terhadap tempat-tempat nonspesifik pada molekul DNA hingga 104, disertai dengan peningkatan afinitas terhadap promoter.

Banyak organisme prokariot, termasuk E. coli, mempunyai beberapa faktor s. Semuanya terlibat dalam pengenalan kelompok-kelompok promoter tertentu. Faktor s dilepaskan dari RNA polimerase inti ketika sintesis RNA mencapai panjang 8 hingga 9 nukleotida. Enzim inti tersebut kemudian akan bergerak di sepanjang molekul DNA sambil menyintesis untai RNA. Sementara itu, faktor s dapat segera bergabung dengan RNA polimerase inti lainnya dan melakukan inisiasi transkripsi kembali. Jumlah faktor s di dalam sel lebih kurang hanya 30% dari jumlah RNA polimerase inti sehingga hanya sepertiga di antara kompleks RNA polimerase yang akan dijumpai dalam bentuk holoenzim pada suatu waktu tertentu.

Promoter s70 pada E. coli

Seperti telah dikatakan di atas, promoter merupakan tempat tertentu pada molekul DNA yang mempunyai urutan basa spesifik untuk pengikatan RNA polimerase dan inisiasi transkripsi. Promoter yang berbeda akan dikenali oleh faktor s RNA polimerase yang berbeda pula. Meskipun demikian, faktor s yang paling umum dijumpai pada E. coli adalah s70.

Promoter pertama kali dikarakterisasi melalui percobaan mutasi yang meningkatkan atau menurunkan laju transkripsi gen-gen seperti halnya gen-gen struktural pada operon lac. Mutagenesis promoter-promoter pada E. coli menunjukkan bahwa urutan basa yang menentukan fungsi promoter tersebut hanyalah suatu urutan yang sangat pendek.

Promoter s70 terdiri atas urutan basa sepanjang 40 hingga 60 pb. Daerah antara –55 dan +20 telah diketahui merupakan daerah pengikatan RNA polimerase, sedangkan daerah antara –20 dan +20 diketahui sangat terlindung dari aktivitas nuklease oleh DNase I.. Hal ini menunjukkan bahwa daerah tersebut sangat berkaitan dengan polimerase yang menghalangi akses nuklease menuju DNA. Mutagenesis promoter memperlihatkan bahwa urutan hingga lebih kurang –40 mempunyai peranan yang penting bagi fungsi promoter. Selain itu, dua urutan sepanjang 6 pb pada posisi sekitar –10 dan –35 terbukti sangat penting bagi fungsi promoter pada E. coli.

Urutan –10

Urutan yang paling lestari (konservatif) pada promoter s70, atau sering dikatakan sebagai urutan konsensus, adalah urutan sepanjang 6 pb yang dijumpai pada promoter-promoter berbagai macam gen pada E. coli. Urutan ini terpusat di sekitar posisi –10 jika dilihat dari tapak inisiasi transkripsi (Gambar 5.2), dan dinamakan kotak Pribnow karena ditemukan oleh Pribnow pada tahun 1975. Urutan konsensus pada kotak Pribnow adalah TATAAT. Kedua basa pertama (TA) dan T yang terakhir merupakan basa-basa yang paling konservatif. Urutan heksamer ini dipisahkan sejauh 5 hingga 8 pb dari tapak inisiasi, dan urutan penyela yang memisahkan urutan -10 dengan tapak inisiasi tersebut tidaklah konservatif. Urutan –10 nampaknya merupakan urutan tempat terjadinya inisiasi pembukaan heliks oleh RNA polimerase.

Gambar 5.2. Urutan konsensus pada promoter-promoter E. coli

Urutan -35

Pada Gambar 5.2 terlihat bahwa selain urutan -10, terdapat pula urutan heksamer lain yang konservatif, yaitu urutan di sekitar posisi -35, yang terdiri atas TTGACA. Urutan ini akan lebih konservatif lagi pada promoter-promoter yang efisien. Tiga basa pertama (TTG) merupakan posisi yang paling konservatif. Pada kebanyakan promoter urutan -35 dipisahkan sejauh 16 hingga 18 pb dari kotak Pribnow, dan urutan penyelanya bukanlah urutan yang penting.

Tapak inisiasi transkripsi

Pada 90% di antara semua gen, tapak inisiasi transkripsi (posisi +1) berupa basa purin, dan dalam hal ini G lebih umum dijumpai daripada A. Di samping itu, basa C dan basa T sering kali mengapit tapak inisiasi sehingga terdapat urutan CGT atau CAT (Gambar 5.2).

Efisiensi promoter

Urutan-urutan konsensus tersebut di atas khas dijumpai pada promoter-promoter yang kuat. Akan tetapi, di antara promoter yang berbeda sebenarnya terdapat variasi urutan yang cukup nyata, yang dapat mengakibatkan perbedaan efisiensi transkripsi hingga 1.000 kali. Secara garis besar, fungsi daerah-daerah pada promoter dapat dijelaskan sebagai berikut. Urutan -35 merupakan urutan pengenalan yang akan meningkatkan pengenalan dan interaksi dengan faktor s RNA polimerase, urutan -10 penting untuk inisiasi pembukaan heliks, dan urutan di sekitar tapak inisiasi mempengaruhi inisiasi transkripsi.

Sementara itu, urutan 30 basa pertama yang akan ditranskripsi juga mempengaruhi transkripsi. Urutan ini mengatur laju pelepasan promoter dari RNA polimerase, yang memungkinkan reinisiasi transkripsi dapat dilakukan oleh kompleks polimerase lainnya. Pada akhirnya hal ini akan berpengaruh terhadap laju transkripsi dan kekuatan promoter.

Pentingnya pemisahan untai DNA pada reaksi inisiasi diperlihatkan oleh pengaruh superkoiling negatif DNA cetakan yang pada umumnya akan memacu laju transkripsi. Hal ini diduga karena struktur superkoil tersebut hanya memerlukan sedikit energi untuk membuka heliks.

Beberapa urutan promoter tidak cukup mirip dengan urutan konsensus yang akan ditranskripsi dengan kuat pada kondisi normal. Sebagai contoh, promoter lac (Plac), yang memerlukan faktor aktivasi tambahan berupa protein reseptor cAMP atau cAMP protein receptor (CPR) untuk mengikat suatu tempat pada DNA yang letaknya berdekatan dengan urutan promoter tersebut agar pengikatan RNA polimerase dan inisiasi transkripsi dapat ditingkatkan. Sejumlah promoter lainnya, misalnya untuk gen-gen yang berhubungan dengan kejut panas, mempunyai urutan konsensus tertentu yang hanya dapat dikenali oleh RNA polimerase dengan faktor s selain s70.

Tahapan transkripsi pada prokariot

Seperti proses transkripsi pada umumnya, transkripsi pada prokariot berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengikatan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Di bawah ini akan dijelaskan pula sekilas tentang pembukaan heliks, yang terjadi antara tahap pengikatan promoter dan insiasi transkripsi.

Pengikatan promoter

Pada awalnya, RNA polimerase inti (a2bb’w) mempunyai afinitas nonspesifik terhadap DNA. Keadaan ini dikenal sebagai pengikatan longgar, dan sifatnya cukup stabil. Namun, begitu faktor s bergabung dengan enzim inti tersebut hingga terbentuk holoenzim, terjadilah pengurangan afinitas nonspesifik terhadap DNA hingga 20.000 kali. Sejalan dengan hal itu, faktor s juga meningkatkan pengikatan holoenzim pada tempat pengikatan promoter yang tepat hingga 100 kali. Dengan demikian, akan terjadi peningkatan spesifisitas holoenzim yang tajam dalam mengenali promoter.

Pada genom E. coli holoenzim dapat mencari dan mengikat promoter dengan sangat cepat. Bahkan, karena begitu cepatnya, maka proses ini tidak mungkin terjadi melalui pengikatan dan pelepasan holoenzim dari DNA secara berulang-ulang. Kemungkinan yang masuk akal hanyalah melalui pergeseran holoenzim di sepanjang molekul DNA hingga mencapai urutan promoter. Pada promoter, holoenzim mengenali urutan -35 dan -10. Kompleks awal antara holoenzim dan promoter dikenal sebagai kompleks tertutup (closed complex).

Pembukaan heliks

Agar pita antisens dapat diakses untuk perpasangan basa antara DNA dan RNA yang disintesis, untai ganda (heliks) DNA harus dibuka terlebih dahulu oleh enzim RNA polimerase. Pada kebanyakan gen pembukaan heliks oleh RNA polimerase akan dimudahkan oleh struktur superkoiling negatif DNA sehingga transkripsi dapat ditingkatkan. Namun, tidak semua promoter dapat diaktivasi oleh superkoiling negatif sehingga terisyaratkan bahwa perbedaan topologi DNA dapat mempengaruhi transkripsi. Hal ini mungkin karena adanya perbedaan hubungan sterik pada urutan -35 dan -10 di dalam heliks. Sebagai contoh, promoter untuk subunit enzim DNA girase justru dihambat oleh superkoiling negatif. Seperti kita ketahui, DNA girase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk superkoiling negatif pada genom E. coli (Bab IV) sehingga superkoiling negatif ini dapat bertindak sebagai umpan balik yang menghambat ekspresi DNA girase.

Pembukaan awal heliks DNA akan menyebabkan pembentukan kompleks terbuka (open complex) dengan RNA polimerase. Proses ini dikenal sebagai pengikatan ketat.

Inisiasi

Berbeda dengan sintesis DNA (Bab IV), sintesis RNA dapat berlangsung tanpa adanya molekul primer. Oleh karena hampir semua tapak inisiasi transkripsi berupa basa G atau A, maka nukleosida trifosfat pertama yang digunakan untuk sintesis RNA adalah GTP atau ATP.

Mula-mula RNA polimerase akan menggabungkan dua nukleotida pertama dan membentuk ikatan fosfodiester di antara kedua nukleotida tersebut. Selanjutnya, sembilan basa pertama ditambahkan tanpa disertai pergeseran RNA polimerase di sepanjang molekul DNA. Pada akhir penambahan masing-masing basa ini akan terdapat peluang yang nyata terjadinya aborsi untai RNA yang baru terbentuk itu. Proses inisiasi abortif mempengaruhi laju transkripsi secara keseluruhan karena proses tersebut memegang peranan utama dalam menentukan waktu yang dibutuhkan oleh RNA polimerase untuk meninggalkan promoter dan memungkinkan RNA polimerase lainnya menginisiasi putaran transkripsi berikutnya. Waktu minimum untuk pengosongan promoter ini adalah 1 hingga 2 detik, suatu waktu yang relatif lama bila dibandingkan dengan waktu untuk tahap-tahap transkripsi lainnya.

Elongasi

Jika inisiasi berhasil, RNA polimerase melepaskan faktor s, dan bersama-sama dengan DNA dan RNA nasen (RNA yang baru disintesis), akan membentuk kompleks terner atau kompleks yang terdiri atas tiga komponen. Dengan adanya kompleks terner ini RNA polimerase dapat berjalan di sepanjang molekul DNA. Artinya, promoter akan ditinggalkannya untuk kemudian ditempati oleh holoenzim RNA polimerase berikutnya sehingga terjadi reinisiasi transkripsi.

Bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks, atau disebut dengan gelembung transkripsi (transcription bubble), akan terlihat bergeser di sepanjang molekul DNA sejalan dengan gerakan RNA polimerase. Panjang bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks tersebut relatif konstan, yakni sekitar 17 pb (Gambar 5.3), sedangkan ujung 5’ molekul RNA yang disintesis akan membentuk heliks hibrid dengan pita antisens DNA sepanjang lebih kurang 12 pb. Ukuran ini ternyata tidak mencapai satu putaran heliks.

RNA polimerase E. coli bergerak dengan kecepatan rata-rata 40 nukleotida per detik. Akan tetapi, angka ini dapat bervariasi sesuai dengan urutan lokal DNA (urutan DNA yang telah dicapai oleh RNA polimerase). Tetap dipertahankannya bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks menunjukkan bahwa RNA polimerase membuka heliks DNA di depan gelembung transkripsi dan menutup heliks DNA di belakangnya. Dengan demikian, heliks hibrid RNA-DNA harus berputar setiap kali terjadi penambahan nukleotida pada RNA nasen.

Terminasi

RNA polimerase tetap terikat pada DNA dan melangsungkan transkripsi hingga mencapai urutan terminator (sinyal stop), yang pada umumnya berupa struktur seperti tusuk konde (hairpin). Struktur yang terdiri atas batang dan kala (loop) ini terjadi karena RNA hasil transkripsi mengalami komplementasi diri. Biasanya, bagian batang sangat kaya dengan GC sehingga sangat stabil (GC mempunyai ikatan rangkap tiga). Di sebelah downstream (3’) dari struktur tusuk kode sering kali terdapat urutan yang terdiri atas empat U atau lebh seperti pada Gambar 5.1.

Nampaknya RNA polimerase akan segera berhenti begitu struktur tusuk konde RNA disintesis. Bagian ujung RNA yang mengandung banyak U tersebut mempunyai ikatan yang lemah dengan basa-basa A pada DNA cetakan sehingga molekul RNA hasil sintesis akan dengan mudah terlepas dari kompleks transkripsi. Selanjutnya, pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segera menempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnya terlepas dari DNA.

Terminasi menggunakan protein rho

Telah disinggung di muka bahwa selain karena adanya struktur tusuk konde, terminasi transkripsi dapat juga terjadi dengan bantuan suatu protein khusus yang dinamakan protein rho (ρ). Rho merupakan protein heksamer yang akan menghidrolisis ATP dengan adanya RNA untai tunggal. Protein ini nampak terikat pada urutan sepanjang 72 basa pada RNA, yang diduga lebih disebabkan oleh pengenalan suatu struktur spesifik daripada karena adanya urutan konsensus. Rho bergerak di sepanjang RNA nasen menuju kompleks transkripsi. Pada kompleks transkripsi ini rho memungkinkan RNA polimerase untuk berhenti pada sinyal terminator tertentu. Sinyal-sinyal terminator ini, seperti halnya sinyal terminator yang tidak bergantung kepada rho, lebih dikenali oleh RNA daripada oleh DNA cetakannya. Adakalanya terminator tersebut juga berupa struktur tusuk konde tetapi tidak dikuti oleh urutan poli U.

Gambar 5.3. Struktur skematik gelembung transkripsi selama elongasi

Transkripsi pada Eukariot
Mekanisme transkripsi pada eukariot pada dasarnya menyerupai mekanisme pada prokariot. Namun, begitu banyaknya polipeptida yang berkaitan dengan mesin transkripsi pada eukariot menjadikan mekanisme tersebut jauh lebih kompleks daripada mekanisme pada prokariot.

Ada tiga macam kompleks RNA polimerase, yang masing-masing diperlukan untuk transkripsi tipe-tipe gen eukariot yang berbeda. Perbedaan ketiga macam RNA polimerase tersebut dapat diketahui melalui pemurnian menggunakan teknik kromatografi dan elusi pada konsentrasi garam yang berbeda. Masing-masing RNA polimerase mempunyai sensitivitas yang berbeda terhadap toksin jamur α-amanitin, dan hal ini dapat digunakan untuk membedakan aktivitasnya satu sama lain.

RNA polimerase I (RNA Pol I) mentranskripsi sebagian besar gen rRNA. Enzim ini terdapat di dalam nukleoli dan tidak sensitif terhadap α-amanitin.

RNA polimerase II (RNA Pol II) mentranskripsi semua gen penyandi protein dan beberapa gen RNA nuklear kecil (snRNA). Enzim ini terdapat di dalam nukleoplasma dan sangat sensitif terhadap α-amanitin.

RNA polimerase III (RNA Pol III) mentranskripsi gen-gen tRNA, 5S rRNA, U6 snRNA dan beberapa RNA kecil lainnya. Enzim ini terdapat di dalam nukleoplasma dan agak sensitif terhadap α-amanitin.

Di samping enzim-enzim nuklear tersebut, sel eukariot juga mempunyai RNA polimerase lainnya di dalam mitokondria dan kloroplas.

Subunit-subunit RNA polimerase pada eukariot

Ketiga RNA polimerase pada eukariot merupakan enzim berukuran besar yang terdiri atas 12 subunit atau lebih. Gen-gen yang menyandi dua subunit terbesar mempunyai homologi satu sama lain. Sementara itu, ketiga RNA polimerase eukariot membawa subunit-subunit yang mempunyai homologi dengan subunit-subunit RNA polimerase inti pada E. coli (α2ββ’). Subunit terbesar RNA polimerase eukariot menyerupai subunit β’, sedangkan subunit terbesar kedua menyerupai subunit β, yang merupakan pusat katalitik RNA polimerase E.coli. Homologi struktur ini ternyata berkaitan dengan homologi fungsional karena subunit terbesar kedua pada RNA polimerase eukariot juga mengandung tapak aktif.

Dua subunit yang sama antara RNA Pol I dan RNA Pol III, serta satu subunit lainnya yang khas pada RNA Pol II, memperlihatkan homologi dengan subunit α RNA polimerase E. coli. Sekurang-kurangnya ada lima subunit lainnya yang lebih kecil, yang memperlihatkan kesamaan di antara ketiga RNA polimerase eukariot. Masing-masing RNA polimerase ini juga membawa empat hingga tujuh subunit tambahan yang hanya dijumpai pada salah satu di antara ketiganya.

Aktivitas RNA polimerase eukariot

Seperti halnya RNA polimerase bakteri, masing-masing RNA polimerase eukariot mengatalisis transkripsi dengan arah 5’ ke 3’ dan menyintesis RNA yang komplementer dengan urutan DNA cetakan. Reaksi tersebut memerlukan prekursor berupa ATP, GTP, CTP, UTP, dan tidak memerlukan primer untuk inisiasi transkripsi. Namun tidak seperti pada bakteri, RNA polimerase eukariot yang dimurnikan memerlukan adanya protein inisiasi tambahan sebelum enzim ini dapat berikatan dengan promoter dan melakukan inisiasi transkripsi.

Gen-gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol I

RNA Pol I bertanggung jawab dalam sintesis rRNA secara terus-menerus selama interfase. Sel manusia mengandung lima rumpun (cluster) gen penyandi rRNA yang terdiri atas sekitar 40 salinan dan terletak pada kromosom-kromosom yang berbeda. Masing-masing gen rRNA menghasilkan transkrip 45S rRNA yang panjangnya lebih kurang 13.000 nukleotida (nt). Transkrip ini akan terbagi menjadi sebuah 28S (5.000 nt), 18S (2.000 nt), dan 5,8S (160 nt) rRNA. Transkripsi salinan gen-gen rRNA secara berkesinambungan diperlukan untuk mencukupi produksi rRNA yang selanjutnya akan dikemas ke dalam ribosom.

Masing-masing rumpun gen rRNA dikenal sebagai daerah pengatur nukleolar (nucleolar organizer region) karena nukleolus mengandung kala (loop) DNA berukuran besar yang sesuai dengan rumpun-rumpun gen tersebut. Setelah sebuah sel dihasilkan dari mitosis, sintesis rRNA akan dimulai kembali dan nukleoli yang kecil akan muncul pada lokasi kromosomal yang ditempati oleh gen-gen rRNA. Selama sintesis rRNA berlangsung aktif, transkrip pra-rRNA dikemas di sepanjang gen-gen rRNA dan jika divisualisasikan menggunakan mikroskop elektron akan nampak sebagai ’struktur pohon natal’. Di dalam struktur ini transkrip-transkrip RNA dikemas dengan rapat di sepanjang molekul DNA dan masing-masing muncul tegak lurus dari DNA. Transkrip yang pendek dapat dilihat pada bagian awal gen tersebut. Transkrip akan makin bertambah panjang pada bagian-bagian berikutnya untuk kemudian menghilang ketika mencapai ujung unit transkripsi.

Promoter-promoter gen pra-rRNA pada mamalia mempunyai suatu daerah kontrol transkripsi bipartit, yang terdiri atas elemen inti atau core element dan elemen kontrol hulu atau upstream control element (UCE), yang secara skema dapat dilihat pada Gambar 5.5. Elemen inti meliputi tapak awal transkripsi dan terbentang dari posisi -31 hingga +6, yang merupakan urutan esensial untuk transkripsi. Sementara itu, UCE mempunyai panjang sekitar 50 hingga 80 pb yang dimulai dari posisi -100. UCE bertanggung jawab untuk peningkatan transkripsi sekitar 10 hingga 100 kali bila dibandingkan dengan laju transkripsi oleh elemen inti saja.

Gambar 5.5. Struktur promoter gen pra-rRNA pada mamalia

UCE akan berikatan dengan suatu protein spesifik pengikat DNA, yang disebut dengan faktor pengikatan hulu atau upstream binding factor (UBF). Selain dengan UCE, UBF juga berikatan dengan suatu urutan di sebelah hulu elemen inti. Kedua urutan yang berikatan dengan UBF tersebut tidak mempunyai kesamaan yang nyata. Sebuah molekul UBF diduga mengikat UCE, sedangkan sebuah molekul UBF lainnya mengikat urutan yang kedua. Selanjutnya, kedua molekul UBF akan saling berikatan melalui interaksi protein-protein sehingga terbentuk struktur kala (loop) pada segmen DNA di antara kedua tempat pengikatan tersebut (Gambar 5.6).

Gambar 5.6. Model skematik inisiasi transkripsi rRNA

Selain UBF, terdapat faktor lain yang esensial untuk transkripsi RNA Pol I. Faktor ini adalah faktor selektivitas atau selectivity factor (SL1), yang akan berikatan dengan kompleks UBF-DNA dan kemudian menstabilkannya. SL1 berinteraksi dengan bagian hilir elemen inti yang bebas. Pengikatan kompleks UBF-DNA oleh SL1 memungkinkan RNA Pol I untuk memasuki kompleks tersebut dan melakukan inisiasi transkripsi.

Saat ini SL1 telah diketahui mengandung beberapa subunit, antara lain berupa suatu protein yang dinamakan protein pengikat TATA atau TATA-binding protein (TBP). TBP diperlukan untuk inisiasi ketiga RNA polimerase eukariot, dan nampaknya merupakan faktor penting dalam transkripsi eukariot. Ketiga subunit SL1 lainnya dikenal sebagai faktor-faktor yang berasosiasi dengan TBP atau TBP-associated factors (TAFs), dan di antara subunit tersebut yang diperlukan untuk transkripsi RNA Pol I dinamakan TAF1s.

Pada Acanthamoeba, suatu eukariot sederhana, terdapat elemen kontrol tunggal di daerah promoter gen rRNA yang terletak sekitar 12 hingga 72 pb ke arah hulu dari titik awal transkripsi. Tempat ini akan diikat oleh faktor TIF-1, yang homolog dengan SL1. Dengan pengikatan ini RNA Pol I akan dapat melakukan inisiasi transkripsi. Pada waktu RNA Pol I bergerak di sepanjang molekul DNA, faktor TIF-1 tetap terikat pada tempat semula sehingga memungkinkan terjadinya inisiasi transkripsi oleh RNA Pol I yang lain, dan beberapa putaran transkripsi dapat berlangsung. Oleh karena itu, mekanisme ini dapat dilihat sebagai sistem kontrol transkripsi yang sangat sederhana. Di sisi lain, untuk vertebrata nampaknya terdapat suatu UBF tambahan yang bertanggung jawab atas pengikatan promoter oleh SL1 secara spesifik.

Gen-gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol III

RNA Pol III terdapat di dalam nukleoplasma dan sekurang-kurangnya terdiri atas 16 subunit yang berbeda. Enzim ini menyintesis prekursor tRNA, 5S rRNA, serta berbagai snRNA dan RNA sitosolik.

Transkrip pertama yang dihasilkan dari gen-gen tRNA merupakan molekul prekursor yang akan diproses menjadi RNA matang. Daerah kontrol transkripsi gen-gen tRNA terletak di sebelah hilir tapak inisiasi transkripsi. Ada dua urutan yang sangat konservatif di dalam gen tRNA, yaitu kotak A (5’- TGGCNNAGTGG - 3’) dan kotak B (5’- GGTTCGANNCC - 3’). Kedua urutan ini juga menyandi urutan penting di dalam tRNA sendiri, yang disebut dengan kala D (D-loop) dan kala TΨC. Hal ini berarti bahwa urutan yang sangat konservatif di dalam tRNA juga merupakan urutan promoter yang sangat konservatif.

Dua faktor pengikatan DNA yang kompleks telah diketahui memegang peranan penting dalam inisiasi transkripsi tRNA oleh RNA Pol III (Gambar 5.7). TFIIIC mengikat baik kotak A maupun kotak B di dalam promoter tRNA. Sementara itu, TFIIIB mengikat daerah sejauh 50 pb ke arah hulu dari kotak A. TFIIIB terdiri atas tiga subunit, yang salah satu di antaranya adalah TBP, suatu faktor inisiasi umum yang diperlukan oleh ketiga RNA polimerase. Subunit yang kedua dan ketiga masing-masing dinamakan BRF dan B’’. Faktor TFIIIB tidak memiliki spesifisitas urutan sehingga tempat pengikatannya bergantung kepada posisi pengikatan TFIIIC pada DNA. TFIIIB memungkinkan RNA Pol III untuk melakukan inisiasi transkripsi. Begitu TFIIIB terikat, TFIIIC dapat dikeluarkan tanpa mempengaruhi transkripsi. Oleh karena itu, TFIIIC dapat dilihat sebagai faktor perakitan untuk penempatan faktor inisiasi TFIIIB.

Gambar 5.7. Inisiasi transkripsi pada promoter tRNA eukariot

RNA Pol III mentranskripsi gen 5S rRNA, yang merupakan satu-satunya subunit rRNA yang ditranskripsi secara terpisah. Seperti halnya gen-gen rRNA lainnya yang ditranskripsi oleh RNA Pol I, gen-gen 5S rRNA tersusun secara tandem (berurutan) di dalam suatu rumpun gen. Pada manusia terdapat suatu rumpun yang berisi sekitar 2.000 gen. Promoter gen 5S rRNA mengandung daerah kontrol internal yang dinamakan kotak C. Letaknya sekitar 81 hingga 99 pb ke arah hilir dari tapak inisiasi transkripsi. Selain itu, terdapat juga kotak A yang berada pada posisi sekitar +50 hingga +65.

Kotak C pada promoter 5S rRNA berperan sebagai tempat pengikatan protein spesifik, yaitu TFIIIA (Gambar 5.8). TFIIIA bekerja sebagai faktor perakitan yang memungkinkan TFIIIC berinteraksi dengan promoter 5S rRNA. Sementara itu, kotak A akan menstabilkan pengikatan TFIIIC sehingga faktor ini berikatan dengan DNA pada posisi yang relatif sama dengan posisi pengikatan pada promoter tRNA. Begitu TFIIIC terikat pada DNA, TFIIIB dapat berinteraksi dengan kompleks pengikatan tersebut dan memungkinkan RNA Pol III untuk melakukan inisiasi transkripsi.

Gambar 5.8. Inisiasi transkripsi pada promoter 5S rRNA eukariot

Banyak gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol III bergantung kepada urutan hulu untuk regulasi transkripsinya. Beberapa promoter seperti U6 snRNA dan gen-gen RNA kecil dari virus Epstein-Barr hanya menggunakan urutan regulator yang letaknya di sebelah hulu dari tapak inisiasi transkripsinya. Daerah penyandi U6 snRNA mempunyai sebuah kotak A yang khas. Akan tetapi, urutan ini tidak diperlukan untuk transkripsi. Daerah hulu pada U6 snRNA mengandung urutan khas promoter RNA Pol II, yang meliputi kotak TATA pada posisi -30 hingga -23. Promoter ini juga memiliki beberapa urutan di daerah hulu sebagai tempat pengikatan faktor transkripsi lainnya seperti pada kebanyakan gen U RNA yang ditranskripsi oleh RNA Pol II. Hal ini mendukung pendapat bahwa faktor-faktor transkripsi umum dapat mengatur gen-gen yang ditranskripsi baik oleh RNA Pol II maupun oleh RNA Pol III.

Terminasi transkripsi oleh RNA Pol III nampaknya hanya memerlukan pengenalan polimerase berupa urutan nukleotida sederhana. Urutan ini terdiri atas sekelompok residu dA yang efisiensi terminasinya dipengaruhi oleh urutan di sekitarnya. Urutan 5’- GCAAAAGC - 3’ merupakan sinyal terminasi yang efisien untuk gen 5S rRNA pada Xenopus borealis.

Gen-gen yang ditranskripsi oleh RNA Pol II

RNA Pol II terdapat di dalam nukleoplasma dan bertanggung jawab untuk transkripsi semua gen penyandi protein dan beberapa gen snRNA. Pra-mRNA (transkrip primer) yang baru disintesis harus mengalami prosesing melalui pembentukan pelindung (cap) pada ujung 5’ RNA dan penambahan poli A pada ujung 3’ di samping pembuangan intron dan penyatuan (splicing) ekson.

Banyak promoter eukariot mengandung suatu urutan konservatif yang dinamakan kotak TATA. Letaknya sekitar 25 hingga 35 pb dari tapak inisiasi transkripsi, berisi urutan konsensus sepanjang 7 pb, yaitu 5’- TATA(A/T)A(A/T) - 3’. Meskipun demikian, saat ini diketahui bahwa protein yang mengikat kotak TATA, yakni TBP, ternyata berikatan dengan urutan sepanjang 8 pb. Tambahan sepasang basa ini letaknya di sebelah hilir dari kotak TATA dan identitasnya tidaklah penting. Kotak TATA bekerja dengan cara yang sama dengan urutan -10 pada promoter E. coli dalam menempatkan RNA Pol II agar diperoleh inisiasi transkripsi yang benar. Meskipun urutan di antara kotak TATA dan tapak inisiasi transkripsi bukan merupakan urutan yang penting, jarak antara kedua tempat tersebut ternyata penting. Hampir 50% tapak inisiasi transkripsi berupa residu A.

Beberapa gen eukariot tidak mempunyai kotak TATA tetapi memiliki suatu elemen insiator, yang terletak di sekitar tapak inisiasi transkripsi. Namun, beberapa promoter tidak memiliki baik kotak TATA maupun elemen inisiator. Gen-gen semacam ini biasanya ditranskripsi dengan lambat, dan inisiasi transkripsi dapat terjadi di tempat-tempat yang berbeda sepanjang 200 pb. Gen-gen ini sering kali mengandung daerah yang kaya GC sepanjang 20 hingga 50 pb pada posisi 100 hingga 200 pb arah hulu dari tapak inisiasi transkripsi.

Aktivitas promoter basal yang rendah akan sangat ditingkatkan oleh adanya elemen-elemen lain di sebelah hulu promoter. Elemen-elemen ini dijumpai pada kebanyakan gen dengan tingkat ekspresi yang sangat bervariasi di antara jaringan yang berbeda. Dua contoh yang umum adalah kotak SP1, yang terletak di sebelah hulu dari banyak gen baik yang mempunyai maupun yang tidak mempunyai kotak TATA, dan kotak CCAAT. Promoter dapat memiliki salah satu, keduanya, atau bahkan banyak salinan urutan/kotak tersebut. Urutan yang pada umumnya terletak 100 hingga 200 pb arah hulu dari promoter ini dinamakan elemen regulator hulu atau upstream regulatory elements (UREs). UREs memegang peranan penting dalam menjamin berlangsungnya transkripsi yang efisien.

Transkripsi kebanyakan promoter eukariot dapat dipacu oleh elemen kontrol yang letaknya beribu-ribu pasang basa dari tapak inisiasi transkripsi. Hal ini pertama kali ditemukan pada genom virus SV40. Suatu urutan sepanjang kira-kira 100 pb pada DNA virus ini dapat dengan nyata meningkatkan transkripsi dari promoter basal. Urutan pemacu (enhancer) ini mempunyai panjang 100 hingga 200 pb dan mengandung banyak elemen yang menghasilkan aktivitas totalnya. Pemacu dapat dijumpai pada sembarang sel atau hanya pada tipe sel tertentu.

Dengan makin banyaknya pemacu dan promoter yang ditemukan, terlihat bahwa motif kedua elemen tersebut ternyata tumpang tindih, baik secara fisik maupun fungsional. Dengan demikian, terdapat spektrum elemen regulator yang sinambung, mulai dari elemen-elemen pemacu yang sangat panjang rentangnya hingga elemen-elemen promoter yang pendek rentangnya.

Serangkaian faktor transkripsi basal yang kompleks telah diketahui berikatan dengan promoter RNA Pol II dan bersama-sama melakukan inisiasi transkripsi. Urutan pembentukan kompleks inisiasi transkripsi RNA Pol II dapat dilihat pada Gambar 5.9.

Gambar 5.9. Diagram pembentukan kompleks inisiasi transkripsi RNA Pol II

Pada promoter yang mengandung kotak TATA, TFIID merupakan faktor pertama yang akan mengikat promoter tersebut. Faktor ini terdiri atas banyak molekul protein, tetapi hanya salah satu di antaranya, yakni protein pengikat TATA atau TATA-binding protein (TBP), yang akan berikatan dengan kotak TATA. Seperti pada RNA Pol I, pada TFIID juga terdapat faktor-faktor yang berasosiasi dengan TBP atau TBP-associated factors (TAFIIS). Pada sel-sel mamalia TBP nampaknya akan berikatan dengan kotak TATA dan kemudian bergabung dengan sekurang-kurangnya delapan TAFIIS untuk membentuk TFIID.

TBP dijumpai pada ketiga kompleks transkripsi eukariot (dalam SL1, TFIIIB, dan TFIID), dan dapat dipastikan memegang peranan penting dalam inisiasi transkripsi. TBP merupakan protein monomerik. Semua TBP eukariot mempunyai domain yang terdiri atas 180 residu asam amino pada ujung C yang sangat konservatif, dan dapat berfungsi sebagai molekul protein seutuhnya pada transkripsi in vivo. Oleh karena itu, fungsi domain pada ujung N yang kurang konservatif belum sepenuhnya diketahui. TBP mempunyai struktur fisik seperti pelana, yang akan mengikat lekukan kecil molekul DNA pada kotak TATA dan menghasilkan sudut 45° di antara kedua pasang basa pertama dan kedua pasang basa terakhir dari 8pb elemen TATA. Mutasi TBP pada domain pengikatannya dengan kotak TATA tetap mempertahankan fungsinya sebagai faktor transkripsi untuk RNA Pol I dan RNA Pol III, tetapi menghalangi inisiasi transkripsi oleh RNA Pol II. Hal ini menunjukkan bahwa RNA Pol I dan RNA Pol III menggunakan TBP untuk inisiasi transkripsi, tetapi peranan TBP itu sendiri yang sesungguhnya pada kompleks transkripsi tersebut masih belum jelas.

Faktor transkripsi berikutnya, TFIIA, akan mengikat TFIID dan meningkatkan stabilitas pengikatan TFIID pada kotak TATA. TFIIA sekurang-kurangnya tersusun dari tiga subunit. Pada studi transkripsi in vitro, yang dilakukan dengan memurnikan TFIID, TFIIA ternyata menjadi tidak dibutuhkan lagi. Namun, pada sel-sel yang utuh TFIIA nampaknya akan menghilangkan pengaruh faktor-faktor penghambat yang berasosiasi dengan TFIID. Jadi, pengikatan TFIIA pada TFIID rupanya akan mencegah masuknya faktor-faktor penghambat tersebut sehingga proses transkripsi dapat berlanjut.

Begitu TFIID terikat dengan stabil pada DNA, faktor transkripsi lainnya, yakni TFIIB, akan berikatan dengan TFIID. Faktor ini akan berperan sebagai perantara yang memungkinkan masuknya RNA Pol II ke dalam kompleks inisiasi transkripsi bersama dengan masuknya faktor berikutnya, TFIIF.

Setelah RNA Pol II terikat pada kompleks inisiasi transkripsi, tiga faktor lainnya, masing-masing TFIIE, TFIIH, dan TFIIJ, segera berasosiasi dengan kompleks tersebut. Ketiga faktor ini diperlukan untuk transkripsi in vitro dan penggabungannya dengan kompleks tersebut terjadi melalui urutan tertentu. Di antara ketiga faktor tersebut, TFIIH merupakan molekul protein terbesar yang sekurang-kurangnya terdiri atas lima subunit. TFIIH mempunyai aktivitas kinase dan helikase. Aktivasi oleh TFIIH akan menyebabkan fosforilasi domain ujung C atau carboxyl-terminal domain (CTD) pada RNA Pol II sehingga terbentuk kompleks RNA Pol II yang siap untuk diproses dan meninggalkan daerah promoter. Dengan demikian, TFIIH nampaknya mempunyai fungsi yang sangat penting dalam kontrol elongasi transkripsi. Komponen-komponen TFIIH juga penting dalam mekanisme perbaikan DNA dan dalam fosforilasi kompleks kinase yang mengatur daur sel.

Pada kebanyakan promoter RNA Pol II yang tidak memiliki kotak TATA terdapat suatu elemen inisiator yang letaknya tumpang tindih dengan tapak inisiasi transkripsi. Rupanya pada promoter semacam ini TBP dimasukkan ke promoter oleh suatu protein pengikat DNA yang terikat pada elemen inisiator. TBP kemudian memasukkan faktor-faktor transkripsi lainnya beserta RNA Pol II dengan cara seperti pada promoter yang mempunyai kotak TATA.

Struktur faktor transkripsi pada eukariot

Faktor-faktor transkripsi pada eukariot mempunyai dua aktivitas yang berbeda, yaitu pengikatan spesifik pada DNA dan aktivasi transkripsi. Masing-masing aktivitas ini dilaksanakan oleh domain-domain protein yang terpisah, yaitu domain pengikatan DNA dan domain aktivasi. Selain itu, banyak faktor transkripsi berupa homodimer atau heterodimer, yang bersama-sama disatukan melalui domain dimerisasi. Beberapa faktor transkripsi mempunyai domain pengikatan ligan yang memungkinkan aktivitas faktor regulasi transkripsi melalui pengikatan suatu molekul tambahan yang berukuran kecil. Reseptor hormon steroid merupakan salah satu contoh protein yang mempunyai keempat macam domain tersebut.

Dari percobaan-percobaan yang dikenal sebagai percobaan pertukaran domain atau domain swap experiments, diketahui bahwa domain pengikatan DNA dan domain aktivasi faktor transkripsi Gal4 dan Gcn4 pada khamir terletak pada bagian protein yang berbeda. Domain aktivasi akan bergabung dengan represor LexA pada bakteri, menghasilkan protein hibrid yang mengaktivasi transkripsi dari promoter dengan urutan operator lexA. Hal ini menunjukkan bahwa fungsi aktivasi transkripsi pada protein khamir terpisah dari aktivitas pengikatan DNAnya.

Ada tiga macam domain pengikatan DNA, yaitu domain helix turn helix, domain zinc finger, dan domain basic. Domain helix turn helix mempunyai sebuah heliks pengenalan yang akan berinteraksi dengan DNA (Gambar 5.10.a). Domain zinc finger mempunyai dua buah kala. Pada domain zinc finger C2H2 masing-masing kala berupa enam asam amino yang berujung pada dua residu sistein dan dua residu histidin. Keempat residu asam amino ini berkoordinat pada suatu ion zinkum (Gambar 5.10.b). Domain basic biasanya berasosiasi dengan salah satu dari dua domain dimerisasi, yaitu leucine zipper atau helix-loop-helix (HLH), sehingga masing-masing dikenal sebagai protein basic leucine zipper (bZIP) dan basic HLH. Dimerisasi protein-protein ini akan membawa kedua domain basic, yang kemudian dapat berinteraksi dengan DNA.

Domain dimerisasi, seperti telah disinggung di atas, dapat berupa protein leucine zipper atau HLH. Leucine zipper mengandung sebuah residu leusin hidrofobik pada setiap posisi ketujuh yang akan berikatan dengan ujung C domain basic. Leusin-leusin pada domain leucine zipper tersusun dalam struktur α-heliks (Gambar 5.11). Domain HLH mempunyai struktur yang menyerupai domain leucine zipper, kecuali dalam hal adanya suatu kala rantai polipeptida yang memisahkan kedua α-heliks protein monomeriknya. Seperti halnya leucine zipper, motif HLH sering kali dijumpai berdekatan dengan domain basic yang memerlukan dimerisasi dalam pengikatan DNA.

Domain aktivasi transkripsi dapat berupa domain aktivasi asam, domain kaya glutamin, atau domain kaya prolin. Domain aktivasi asam mengandung banyak sekali residu asam amino yang bersifat asam sehingga sering disebut juga dengan ’gumpalan asam’ atau ’gumpalan negatif’. Masih belum diketahui dengan pasti gambaran struktur lainya yang diperlukan oleh domain ini agar dapat berfungsi sebagai domain aktivasi transkripsi yang efisien. Domain kaya glutamin pertama kali ditemukan pada faktor transkripsi SP1. Pada domain ini banyak sekali ditemukan residu glutamin. Begitu juga, pada domain kaya prolin banyak sekali ditemukan residu prolin.

Regulasi transkripsi dapat terjadi melalui interaksi tidak langsung dengan fungsi suatu faktor transkripsi, antara lain dengan blokade tempat pengikatan faktor transkripsi pada DNA (seperti pada kebanyakan represor prokariot), pembentukan kompleks pengikatan non-DNA (misalnya protein inhibitor Id yang tidak mempunyai domain pengikatan DNA akan menggangu interaksi protein HLH dengan DNA), dan blokade domain aktivasi faktor transkripsi meskipun pengikatannya pada DNA tetap berlangsung (misalnya Gal80 akan menutupi domain aktivasi faktor transkrispi Gal4 pada khamir). Di samping itu, penghambatan transkripsi dapat juga terjadi secara langsung karena adanya domain tertentu pada represor. Sebagai contoh, suatu domain reseptor hormon tiroid pada mamalia akan menekan transkripsi apabila tidak ada hormon tiroid dan akan mengaktifkannya apabila terikat pada hormon tersebut. Begitu pula, produk gen tumor Wilms berupa protein WT1 yang akan menekan tumor, mempunyai domain represor spesifik yang banyak mengandung prolin.

Gambar 5.10. Domain pengikatan DNA

a) helix turn helix

b) zinc finger C2H2

Gambar 5.11. Protein bZIP (dimer antara domain leucine zipper dan domain basic)

Replikasi DNA

2009-01-21T02:22:00.000+07:00

Fungsi DNA sebagai Materi Genetik

DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme harus dapat menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini.

DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi. Inilah materi yang akan dibahas di dalam bab ini.

DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang dilaksanakan melalui ekspresi gen (Bab V hingga Bab VII).

DNA sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah. Tanpa perubahan semacam ini, evolusi tidak akan pernah berlangsung. Fungsi ini merupakan fungsi evolusioner, yang dilaksanakan melalui peristiwa mutasi (Bab VIII).

...

Mekanisme Replikasi Semikonservatif

Ada tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Pada replikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru. konservatif semikonservatif dispersifGambar 4.1. Tiga cara teoretis replikasi DNA
= untai lama = untai baruDi antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.

Mereka menumbuhkan bakteri Escherichia coli selama beberapa generasi di dalam medium yang mengandung isotop nitrogen 15N untuk menggantikan isotop nitrogen normal 14N yang lebih ringan. Akibatnya, basa-basa nitrogen pada molekul DNA sel-sel bakteri tersebut akan memiliki 15N yang berat. Molekul DNA dengan basa nitrogen yang mengandung 15N mempunyai tingkat kerapatan (berat per satuan volume) yang lebih tinggi daripada DNA normal (14N). Oleh karena molekul-molekul dengan tingkat kerapatan yang berbeda dapat dipisahkan dengan cara sentrifugasi tersebut di atas, maka Meselson dan Stahl dapat mengikuti perubahan tingkat kerapatan DNA sel-sel bakteri E. coli yang semula ditumbuhkan pada medium 15N selama beberapa generasi, kemudian dikembalikan ke medium normal 14N selama beberapa generasi berikutnya.

Molekul DNA mempunyai kerapatan yang lebih kurang sama dengan kerapatan larutan garam yang sangat pekat seperti larutan 6M CsCl (sesium khlorida). Sebagai perbandingan, kerapatan DNA E.coli dengan basa nitrogen yang mengandung isotop 14N dan 15N masing-masing adalah 1,708 g/cm3 dan 1,724 g/cm3, sedangkan kerapatan larutan 6M CsCl adalah 1,700 g/cm3.

Ketika larutan 6M CsCl yang di dalamnya terdapat molekul DNA disentrifugasi dengan kecepatan sangat tinggi, katakanlah 30.000 hingga 50.000 rpm, dalam waktu 48 hingga 72 jam, maka akan terjadi keseimbangan tingkat kerapatan. Hal ini karena molekul-molekul garam tersebut akan mengendap ke dasar tabung sentrifuga akibat adanya gaya sentrifugal, sementara di sisi lain difusi akan menggerakkan molekul-molekul garam kembali ke atas tabung. Molekul DNA dengan tingkat kerapatan tertentu akan menempati kedudukan yang sama dengan kedudukan larutan garam yang tingkat kerapatannya sama dengannya.

medium 15N ekstrak DNA
(generasi 0)

ekstrak DNA
medium 14N (generasi 1)

ekstrak DNA
(generasi 2)
medium 14N

ekstrak DNA
medium 14N (generasi 3)
interpretasi data hasil sentrifugasi DNA

Gambar 4.2. Diagram percobaan Meselson dan Stahl yang memperlihatkan replikasi DNA secara semikonservatifDNA yang diekstrak dari sel E. coli yang ditumbuhkan pada medium 15N terlihat menempati dasar tabung. Selanjutnya, DNA yang diekstrak dari sel E.coli yang pertama kali dipindahkan kembali ke medium 14N terlihat menempati bagian tengah tabung. Pada generasi kedua setelah E.coli ditumbuhkan pada medium 14N ternyata DNAnya menempati bagian tengah dan atas tabung. Ketika E.coli telah ditumbuhkan selama beberapa generasi pada medium 14N, DNAnya nampak makin banyak berada di bagian atas tabung, sedangkan DNA yang berada di bagian tengah tabung tetap. Meselson dan Stahl menjelaskan bahwa pada generasi 15N, atau dianggap sebagai generasi 0, DNAnya mempunyai kerapatan tinggi. Kemudian, pada generasi 14N yang pertama, atau disebut sebagai generasi 1, DNAnya merupakan hibrid antara DNA dengan kerapatan tinggi dan rendah. Pada generasi 2 DNA hibridnya masih ada, tetapi muncul pula DNA baru dengan kerapatan rendah. Demikian seterusnya, DNA hibrid akan tetap jumlahnya, sedangkan DNA baru dengan kerapatan rendah akan makin banyak dijumpai. Pada Gambar 4.2 terlihat bahwa interpretasi data hasil percobaan sentrifugasi ini jelas sejalan dengan cara pembentukan molekul DNA melalui replikasi semikonservatif.

Pada percobaan Meselson dan Stahl ekstrak DNA yang diperoleh dari sel-sel E. coli berada dalam keadaan terfragmentasi sehingga replikasi molekul DNA dalam bentuknya yang utuh sebenarnya belum diketahui. Replikasi DNA kromosom dalam keadaan utuh _ yang pada prokariot ternyata berbentuk melingkar atau sirkular _ baru dapat diamati menggunakan teknik autoradiografi dan mikroskopi elektron. Dengan kedua teknik ini terlihat bahwa DNA berbagai virus, khloroplas, dan mitokhondria melakukan replikasi yang dikenal sebagai replikasi θ (theta) karena autoradiogramnya menghasilkan gambaran seperti huruf Yunani tersebut. Selain replikasi θ, pada sejumlah bakteri dan organisme eukariot dikenal pula replikasi yang dinamakan replikasi lingkaran menggulung (rolling circle replication). Replikasi ini diawali dengan pemotongan ikatan fosfodiester pada daerah tertentu yang menghasilkan ujung 3’ dan ujung 5’. Pembentukan (sintesis) untai DNA baru terjadi dengan penambahan deoksinukleotida pada ujung 3’ yang diikuti oleh pelepasan ujung 5’ dari lingkaran molekul DNA. Sejalan dengan berlangsungnya replikasi di seputar lingkaran DNA, ujung 5’ akan makin terlepas dari lingkaran tersebut sehingga membentuk ’ekor’ yang makin memanjang (Gambar 4.3).

penambahan
nukleotida
ujung 3’
tempat ujung 5’ pelepasan ujung 5’ pemanjangan ’ekor’
terpotongnya ikatan fosfodiester

Gambar 4.3. Replikasi lingkaran menggulung
= untai lama = untai baruReplikon, Ori, Garpu Replikasi, dan Termini

Setiap molekul DNA yang melakukan replikasi sebagai suatu satuan tunggal dinamakan replikon. Dimulainya (inisiasi) replikasi DNA terjadi di suatu tempat tertentu di dalam molekul DNA yang dinamakan titik awal replikasi atau origin of replication (ori). Proses inisiasi ini ditandai oleh saling memisahnya kedua untai DNA, yang masing-masing akan berperan sebagai cetakan bagi pembentukan untai DNA baru sehingga akan diperoleh suatu gambaran yang disebut sebagai garpu replikasi. Biasanya, inisiasi replikasi DNA, baik pada prokariot maupun eukariot, terjadi dua arah (bidireksional). Dalam hal ini dua garpu replikasi akan bergerak melebar dari ori menuju dua arah yang berlawanan hingga tercapai suatu ujung (terminus). Pada eukariot, selain terjadi replikasi dua arah, ori dapat ditemukan di beberapa tempat.

Replikasi pada kedua untai DNA

Proses replikasi DNA yang kita bicarakan di atas sebenarnya barulah proses yang terjadi pada salah satu untai DNA. Untai DNA tersebut sering dinamakan untai pengarah (leading strand). Sintesis DNA baru pada untai pengarah ini berlangsung secara kontinyu dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai pengarah dari ujung 3’ ke ujung 5’.

Pada untai DNA pasangannya ternyata juga terjadi sintesis DNA baru dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai DNA cetakannya ini dari ujung 3’ ke ujung 5’. Namun, sintesis DNA pada untai yang satu ini tidak berjalan kontinyu sehingga menghasilkan fragmen terputus-putus, yang masing-masing mempunyai arah 5’→ 3’. Terjadinya sintesis DNA yang tidak kontinyu sebenarnya disebabkan oleh sifat enzim DNA polimerase yang hanya dapat menyintesis DNA dari arah 5’ ke 3’ serta ketidakmampuannya untuk melakukan inisiasi sintesis DNA.

Untai DNA yang menjadi cetakan bagi sintesis DNA tidak kontinyu itu disebut untai tertinggal (lagging strand). Sementara itu, fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dari sintesis yang tidak kontinyu dinamakan fragmen Okazaki, sesuai dengan nama penemunya. Fragmen-fragmen Okazaki akan disatukan menjadi sebuah untai DNA yang utuh dengan bantuan enzim DNA ligase.

fragmen-fragmen untai tertinggal
3’ Okazaki 5’
5’ 3’ 5’ 3’
untai pengarah

Gambar 4.4. Diagram replikasi pada kedua untai DNA

Replikasi DNA prokariot

Replikasi DNA kromosom prokariot, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi, DNA kromosom prokariot dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang baru terbentuk, sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi sintesis pada untai pengarah.

Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.

Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’® 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’® 3’, eksonuklease 5’ ® 3’, dan eksonuklease penyuntingan 3’ ® 5’. Eksonuklease 5’ ® 3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.

Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180°C dari ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

Replikasi DNA eukariot

Pada eukariot replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariot bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.
Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukomatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. DNA sentromir dan telomir bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.
Seperti halnya pada prokariot, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariot (telomir) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.

Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.

Struktur Molekul Kromosom

2009-01-21T02:19:00.000+07:00

Struktur Molekuler Kromosom Prokariot

Gambaran umum genom prokariot dapat diwakili oleh kromosom E. coli, yang merupakan gulungan DNA tunggal berbentuk sirkuler tertutup sepanjang 4,6 x 106 pb. Seperti telah dijelaskan pada Bab I, DNA tersebut dikemas di suatu tempat di dalam sel yang dinamakan nukleoid. Di tempat ini terdapat konsentrasi DNA yang sangat tinggi, mungkin mencapai 30 hingga 50 mg/ml, dan semua protein yang berhubungan dengan DNA seperti polimerase, represor, dan lain sebagainya.

Percobaan-percobaan yang memungkinkan isolasi DNA E. coli dari semua protein yang melekat padanya serta pengamatan melalui mikroskop elektron dapat menunjukkan satu tingkat organisasi nukleoid. Ternyata, DNA terdiri atas 50 hingga 100 domain atau kala (loop), yang ujung-ujungnya dipersatukan oleh suatu struktur yang diduga terdiri atas protein-protein terikat membran plasma (Gambar 3.1). Masing-masing kala tersebut berukuran lebih kurang 50 hingga 100 kb. Belum diketahui apakah kala bersifat statis atau dinamis, tetapi ada satu model yang menyebutkan bahwa DNA mungkin berputar-putar melalui struktur pemersatu yang ada di dasar kala tersebut.

...

Kromosom E. coli secara keseluruhan mengalami superkoiling negatif (berkebalikan dengan arah putaran heliks untai ganda DNA) meskipun ada bukti bahwa masing-masing domain dapat mengalami superkoiling secara independen. Bahkan, gambaran mikrograf elektron menunjukkan bahwa beberapa domain tidak mengalami superkoiling, mungkin karena salah satu untai DNAnya patah.

Protein-protein terikat membran plasma yang terdapat pada struktur pemersatu domain ada beberapa macam. Protein yang paling banyak dijumpai adalah HU, suatu protein dimerik (mempunyai dua subunit) yang bersifat basa dan H-NS (dulu disebut H1), suatu protein monomerik netral. Kedua-duanya mengikat DNA secara nonspesifik dalam arti tidak bergantung kepada sekuens tertentu, dan sering dikatakan sebagai protein mirip histon. Akibat pengikatan oleh kedua protein tersebut DNA menjadi kompak. Hal ini sangat penting bagi pengemasan DNA di dalam nukleoid dan stabilisasi superkoiling kromosom.

Struktur Molekuler Kromosom Eukariot

Berbeda dengan DNA prokariot yang berbentuk sirkuler tertutup, DNA eukariot merupakan molekul linier yang sangat panjang. Panjang DNA eukariot di dalam nukleus jauh melebihi ukuran nukleus itu sendiri. Oleh karenanya, agar dapat dikemas di dalam nukleus, DNA harus dimampatkan dengan suatu cara. Derajad pemampatan (kondensasi) DNA dinyatakan sebagai nisbah pengepakan (packing ratio)-nya, yaitu panjang molekul DNA dibagi dengan panjang pengepakannya. Sebagai contoh, kromosom manusia yang terpendek, yaitu kromosom nomor 21, berisi 4,6 x 107 pb DNA (sekitar 10 kali ukuran genom E. coli). Ukuran DNA kromosom ini setara dengan panjang 14.000 μm jika DNA ditarik lurus. Pada kondisi yang paling mampat, yaitu selama mitosis, kromosom tersebut panjangnya hanya sekitar 2 μm. Angka ini memberikan nisbah pengepakan sebesar 7.000 (14.000/2).

Untuk mencapai nisbah pengepakan totalnya, DNA tidak langsung dikemas ke dalam struktur terakhirnya (kromatin). Pengemasan DNA dilakukan melalui sejumlah tingkatan organisasi kromosom. Tingkatan yang pertama diperoleh ketika DNA melilit-lilit di sekeliling sumbu protein sehingga menghasilkan struktur seperti manik-manik yang disebut nukleosom. Pada tingkatan ini terdapat nisbah pengepakan sebesar 6. Tingkatan yang kedua adalah pemutaran sejumlah nukleosom membentuk struktur heliks yang disebut serabut 30 nm. Struktur serabut 30 nm dijumpai baik pada kromatin interfase maupun pada kromosom mitosis. Dengan struktur ini nisbah pengepakan DNA meningkat menjadi sekitar 40. Pengemasan terakhir terjadi ketika serabut 30 nm tersusun dalam sejumlah kala, struktur tangga, dan domain, yang memberikan nisbah pengepakan tertinggi sebesar lebih kurang 1.000 pada kromatin interfase dan 10.000 pada kromosom mitosis.

Kromosom eukariot terdiri atas suatu kompleks DNA-protein yang tersusun sangat kompak sehingga memungkinkan DNA yang ukurannya begitu panjang tersimpan di dalam nukleus. Istilah bagi struktur dasar kromosom adalah kromatin, sedangkan satuan dasar kromatin adalah nukleosom. Dengan demikian, kromatin merupakan satuan analisis kromosom yang menggambarkan struktur umum kromosom.

Nukleosom

Nukleosom dijumpai pada semua kromosom eukariot. Telah dikatakan di atas bahwa nukleosom merupakan struktur yang paling sederhana dalam pengemasan DNA eukariot. Pengemasan terjadi dengan cara pelilitan DNA di sekeliling sumbu nukleosom, yang merupakan oktamer protein basa berukuran kecil dan disebut histon sumbu. Protein histon sumbu ini bersifat basa atau bermuatan positif karena banyak mengandung asam amino arginin dan lisin.

Ada empat macam histon sumbu yang menyusun sumbu nukleosom, yaitu H2A, H2B, H3, dan H4. Keempat macam histon ini berada dalam bentuk oktamer karena masing-masing terdiri atas dua molekul. Selain itu, ada satu macam histon lagi, yaitu H1, yang letaknya bukan di sumbu nukleosom, melainkan di bagian tepi nukleosom. Dengan adanya molekul H1 ini, ukuran nukleosom menjadi lebih besar 20 pb dan biasanya disebut dengan kromatosom.

Setiap untai DNA sepanjang 146 pb mengelilingi satu sumbu nukleosom, sementara bagian-bagian DNA lainnya menjadi penghubung (linker) antara satu sumbu nukleosom dan sumbu nukleosom berikutnya. Pelilitan DNA di sekeliling sumbu nukleosom berlangsung dengan arah ke kiri atau terjadi superkoiling negatif. Pelilitan terjadi demikian kuat karena DNA bermuatan negatif, sedangkan histon sumbu bermuatan positif.

Gambar 3.2. Struktur skematik nukleosom dan kromatosom

Serabut 30 nm

Telah dikatakan di atas bahwa terbentuknya rangkaian heliks nukleosom secara keseluruhan terlihat sebagai serabut dengan diameter 30 nm yang dikenal sebagai serabut 30 nm (Gambar 3.3). Keberadaan histon H1 berfungsi menstabilkan struktur serabut 30 nm. Hal ini didukung oleh bukti percobaan bahwa penghilangan histon tersebut dari kromatin ternyata tidak dapat mempertahankan struktur serabut 30 nm meskipun struktur nukleosomnya tetap dipertahankan.

Hasil studi menggunakan mikroskop elektron menunjukkan bahwa nukleosom-nukleosom di dalam serabut 30 nm membentuk heliks yang berputar ke arah kiri dengan jumlah nukleosom sebanyak enam buah tiap putaran. Meskipun demikian, organisasi struktur serabut 30 nm yang tepat sebenarnya masih berupa suatu perkiraan.

Struktur kromatin yang tertinggi

Organisasi kromatin pada tingkatan yang paling tinggi nampak agak menyerupai struktur DNA prokariot. Hasil pengamatan menggunakan mikroskop elektron terhadap kromosom eukariot yang telah dibersihkan dari protein-protein histonnya memperlihatkan gambaran struktur domain (kala) seperti pada kromosom prokariot (Gambar 3.1). Bahkan, ukuran tiap kalanya pun lebih kurang sama, yaitu hingga sekitar 100 kb. Meskipun demikian, pada kromosom eukariot terdapat lebih banyak kala.

Kala-kala tersebut dipersatukan oleh kompleks protein yang dinamakan matriks nuklear. DNA di dalam kala berada dalam bentuk serabut 30 nm, dan kala-kala tersebut membentuk susunan yang membentang sekitar 300 nm (Gambar 3.4).

Gambar 3.3. Struktur skematik serabut 30 nm

Gambar 3.4. Organisasi serabut 30 nm ke dalam domain kromosom

Kromosom mitosis

Gambaran fisik kromosom eukariot yang dapat kita lihat dengan jelas adalah ketika kromosom mengalami kondisi yang paling mampat pada tahap mitosis, khususnya metafase. Pada waktu kromosom-kromosom hasil replikasi ditarik ke dua kutub yang berlawanan, DNA kromosom yang mempunyai nisbah aksial sangat tinggi (sangat tipis memanjang) seharusnya akan terpotong-potong oleh kekuatan penarikan tersebut. Namun, tidaklah demikian kenyataannya. Hal ini karena, seperti telah disinggung di atas, DNA kromosom eukariot telah mencapai nibah pengepakan yang paling tinggi.

Gambar 3.5. Struktur kromosom mitosis

Sentromir

Sentromir merupakan daerah pada kromosom eukariot yang mengalami penyempitan dan menjadi tempat bersatunya dua kromatid kembar (kromosom hasil replikasi) pada saat metafase. Di dalam sentromir terjadi perakitan kinetokor, suatu kompleks protein yang berikatan dengan mikrotubulus dari benang spindel. Mikrotubulus akan bekerja memisahkan kromatid kembar pada anafase. Oleh karena itu, dengan adanya sentromir, segregasi kromatid kembar ke masing-masing kutub sel dapat berlangsung dengan tepat.

DNA pada sentromir khamir diketahui hanya terdiri atas suatu sekuens pendek (88 pb) yang kaya akan AT dan diapit oleh dua sekuens konservatif (selalu tetap) yang sangat pendek. Sementara itu, DNA pada sentromir mamalia berupa sekuens yang agak lebih panjang dan diapit oleh sejumlah besar sekuens repetitif (berulang) yang disebut dengan DNA satelit.

Telomir

Telomir adalah ujung kromosom eukariot yang sekaligus juga merupakan ujung molekul DNA. Sebuah telomir terdiri atas beratus-ratus salinan (copy) sekuens pendek repetitif yang disintesis oleh enzim telomerase dengan mekanisme yang tidak bergantung kepada replikasi DNA biasa. Pada manusia, misalnya, sekuens ini berupa 5’-TTAGGG-3’.

DNA telomerik membentuk struktur sekunder tertentu, yang fungsinya untuk melindungi ujung kromosom dari degradasi. Sintesis DNA telomerik yang bersifat independen dari replikasi DNA lainnya akan mengimbangi terjadinya pemendekan kromosom secara bertahap. Pemendekan itu sendiri terjadi karena ketidakmampuan replikasi biasa untuk menyintesis bagian yang paling ujung pada suatu molekul DNA linier.

Kromosom interfase

Pada waktu interfase, gen-gen di dalam kromosom mengalami transkripsi. Demikian pula, replikasi DNA berlangsung. Selama kurun waktu tersebut, yang merupakan bagian terbesar di antara tahapan-tahapan daur sel, kromosom mempunyai struktur yang sangat baur dan tidak dapat dilihat satu demi satu. Meskipun demikian, diyakini bahwa kala-kala kromosomal seperti pada Gambar 3.4. tetap ada dan terikat pada matriks nuklear.

Heterokromatin

Bagian kromatin yang selama interfase tetap nampak sangat kompak meskipun tidak sekompak ketika metafase dinamakan heterokromatin. Jika diamati di bawah mikroskop, heterokromatin terlihat sebagai daerah yang gelap di bagian tepi nukleus. Dewasa ini telah diketahui bahwa heterokromatin berisi sejumlah sekuens repetitif yang secara genetik tidak aktif atau tidak banyak mengalami transkripsi. Diyakini bahwa kebanyakan heterokromatin terdiri atas DNA satelit yang letaknya berdekatan dengan sentromir. Meskipun demikian, dalam kasus tertentu seluruh kromosom bisa saja berupa heterokromatin, misalnya salah satu dari dua kromosom X pada mamalia betina.

Eukromatin
Eukromatin adalah bagian kromatin yang berisi sekuens-sekuens nonrepetitif (tunggal, tidak berulang) yang secara genetik sangat aktif atau banyak mengalami transkripsi. Kenampakannya tidak sejelas heterokromatin. Meskipun demikian, eukromatin tidaklah homogen sempurna. Masih banyak juga daerah-daerah yang secara genetik relatif inaktif. Hanya sekitar 10% di antaranya merupakan daerah dengan gen-gen yang sedang dan akan ditranskripsi. Di daerah semacam ini serabut 30 nm mengalami disosiasi menjadi struktur seperti tasbih. Bahkan, beberapa bagian di antaranya kehilangan nukleosom. Diduga hal ini dimaksudkan untuk memudahkan pengikatan faktor-faktor transkripsi dan protein lainnya.

Sensitivitas kromatin terhadap enzim DNase I, yang memotong tulang punggung molekul DNA kecuali jika DNA tersebut terlindungi oleh protein yang terikat padanya, telah digunakan untuk memetakan daerah-daerah yang aktif mengalami transkripsi. Daerah-daerah pendek yang hipersensitif terhadap DNase I dianggap menggambarkan daerah yang serabut 30 nm-nya diselingi oleh pengikatan suatu protein regulator tertentu sehingga memperlihatkan DNA yang tebuka dan mudah diserang oleh DNase I. Sementara itu, daerah sensitif yang lebih panjang menggambarkan sekuens-sekuens yang mengalami transkripsi. Daerah-daerah tersebut bevariasi di antara jenis sel yang berbeda, sesuai dengan tempat gen yang akan diekspresikan pada sel tertentu.

Suatu modifikasi kimia penting yang diduga terlibat dalam sinyal pengemasan kromosom di tempat gen-gen yang diekspresikan pada sel-sel mamalia adalah metilasi atom C ke 5 pada basa sitosin (C) dengan sekuens 5’-CG-3’, yang biasa dikenal sebagai metilasi CpG. Keberadaan CpG biasanya relatif jarang karena 5-metil sitosin secara spontan akan mengalami deaminasi menjadi timin. Metilasi CpG berkaitan dengan daerah-daerah kromatin yang tidak aktif mengalami transkripsi. Akan tetapi, ada daerah sepanjang lebih kurang 2 kb yang dinamakan kepulauan CpG, yang berisi CpG yang tidak mengalami metilasi dan ternyata sensitif terhadap DNase I. Kepulauan CpG menjadi tempat pengikatan promoter gen-gen yang akan ditranskripsi.

Gambar 3.6. Eukromatin

Kompleksitas Genom Eukariot

Genom organisme eukariot dapat mengandung jumlah DNA lebih dari 1000 kali jumlah yang ada pada genom prokariot seperti E. coli. Akan tetapi, banyaknya protein pada eukariot, misalnya manusia, tidaklah 1000 kali jumlah protein pada E. coli. Dengan demikian, dapat dipastikan bahwa tidak semua sekuens DNA eukariot menyandi pembentukan protein. Sekuens DNA eukariot yang tidak menyandi sintesis protein ini dinamakan intron.

Intron akan menginterupsi daerah penyandi protein (coding sequence) di dalam gen-gen eukariot sehingga sekuens gen-gen tersebut dapat mencakup panjang beberapa kilobasa tetapi tidak semuanya merupakan coding sequence. Hingga sekarang fungsi intron, kalau pun ada, tidak diketahui. Hal yang pasti adalah bahwa kebanyakan intron terdiri atas sejumlah pengulangan salinan beberapa macam sekuens yang serupa atau sama. Salinan sekuens tersebut dapat dijumpai berurutan (tandemly repeated) seperti pada DNA satelit yang ada di dekat sentromir, atau tersebar (interspersed) di sepanjang genom, misalnya pada elemen Alu pada genom manusia.

Kecepatan renaturasi atau kinetika reasosiasi sampel DNA kromosom digambarkan sebagai kurva yang dikenal sebagai kurva Cot. Pemberian nama ini berkaitan dengan variabel-variabel yang dihubungkan. Sumbu X memetakan variabel yang merupakan hasil kali konsentrasi DNA awal (Co) dengan waktu yang dibutuhkan untuk renaturasi (t). Sementara itu, sumbu Y memetakan banyaknya fragmen DNA yang masih tetap berupa untai tunggal (f).

Kurva Cot untuk DNA kromosom manusia memperlihatkan adanya tiga fase, yaitu fase cepat, fase sedang, dan fase lambat. Fase cepat menunjukkan bahwa fragmen-fragmen untai tunggal membawa sekuens repetitif yang sangat banyak sehingga mudah sekali untuk mengalami renaturasi. Fase sedang menunjukkan bahwa fragmen-fragmen untai tunggal membawa sekuens repetitif dalam jumlah yang tidak terlalu besar sehingga kecepatan renaturasinya pun sedang-sedang saja. Fase lambat menunjukkan bahwa fragmen-fragmen untai tunggal sedikit sekali atau sama sekali tidak membawa sekuens repetitif sehingga sangat sulit untuk mengalami renaturasi. Dengan demikian, genom atau DNA kromosom manusia dapat dibagi dalam tiga daerah, yaitu daerah dengan banyak sekuens repetitif (highly repetitive DNA), daerah dengan beberapa sekuens repetitif (moderately repetitive DNA), dan daerah dengan sekuens unik atau tanpa sekuens repetitif. Sementara itu, genom prokariot, misalnya E. coli, hanya terdiri atas sekuens-sekuens unik

Asam Nukleat

2009-01-21T02:11:00.000+07:00

Struktur Molekul

Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida (basa N).

Ada dua macam asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA). Dilihat dari strukturnya, perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini terutama terletak pada komponen gula pentosanya. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor 2’ sehingga dinamakan gula 2’-deoksiribosa (Gambar 2.1.b).

Perbedaan struktur lainnya antara DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA, mempunyai struktur berupa cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) dan dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil.

...

Gambar 2.1. Komponen-komponen asam nukleat

a) gugus fosfat b) gula pentosa c) basa N

Di antara ketiga komponen monomer asam nukleat tersebut di atas, hanya basa N-lah yang memungkinkan terjadinya variasi. Pada kenyataannya memang urutan (sekuens) basa N pada suatu molekul asam nukleat merupakan penentu bagi spesifisitasnya. Dengan perkataan lain, identifikasi asam nukleat dilakukan berdasarkan atas urutan basa N-nya sehingga secara skema kita bisa menggambarkan suatu molekul asam nukleat hanya dengan menuliskan urutan basanya saja.

Nukleosida dan nukleotida

Penomoran posisi atom C pada cincin gula dilakukan menggunakan tanda aksen (1’, 2’, dan seterusnya), sekedar untuk membedakannya dengan penomoran posisi pada cincin basa. Posisi 1’ pada gula akan berikatan dengan posisi 9 (N-9) pada basa purin atau posisi 1 (N-1) pada basa pirimidin melalui ikatan glikosidik atau glikosilik (Gambar 2.2). Kompleks gula-basa ini dinamakan nukleosida.

Di atas telah disinggung bahwa asam nukleat tersusun dari monomer-monomer berupa nukleotida, yang masing-masing terdiri atas sebuah gugus fosfat, sebuah gula pentosa, dan sebuah basa N. Dengan demikian, setiap nukleotida pada asam nukleat dapat dilihat sebagai nukleosida monofosfat. Namun, pengertian nukleotida secara umum sebenarnya adalah nukleosida dengan sebuah atau lebih gugus fosfat. Sebagai contoh, molekul ATP (adenosin trifosfat) adalah nukleotida yang merupakan nukleosida dengan tiga gugus fosfat.

Jika gula pentosanya adalah ribosa seperti halnya pada RNA, maka nukleosidanya dapat berupa adenosin, guanosin, sitidin, dan uridin. Begitu pula, nukleotidanya akan ada empat macam, yaitu adenosin monofosfat, guanosin monofosfat, sitidin monofosfat, dan uridin monofosfat. Sementara itu, jika gula pentosanya adalah deoksiribosa seperti halnya pada DNA, maka (2’-deoksiribo)nukleosidanya terdiri atas deoksiadenosin, deoksiguanosin, deoksisitidin, dan deoksitimidin.

Ikatan fosfodiester

Selain ikatan glikosidik yang menghubungkan gula pentosa dengan basa N, pada asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang menghubungkan antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5’ gula pentosa dan gugus hidroksil pada posisi 3’ gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester (Gambar 2.2).

Gambar 2.2. Ikatan fosfodiester dan ikatan glikosidik pada asam nukleat

Oleh karena ikatan fosfodiester menghubungkan gula pada suatu nukleotida dengan gula pada nukleotida berikutnya, maka ikatan ini sekaligus menghubungkan kedua nukleotida yang berurutan tersebut. Dengan demikian, akan terbentuk suatu rantai polinukleotida yang masing-masing nukleotidanya satu sama lain dihubungkan oleh ikatan fosfodiester.

Kecuali yang berbentuk sirkuler, seperti halnya pada kromosom dan plasmid bakteri, rantai polinukleotida memiliki dua ujung. Salah satu ujungnya berupa gugus fosfat yang terikat pada posisi 5’ gula pentosa. Oleh karena itu, ujung ini dinamakan ujung P atau ujung 5’. Ujung yang lainnya berupa gugus hidroksil yang terikat pada posisi 3’ gula pentosa sehingga ujung ini dinamakan ujung OH atau ujung 3’. Adanya ujung-ujung tersebut menjadikan rantai polinukleotida linier mempunyai arah tertentu.

Pada pH netral adanya gugus fosfat akan menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif. Inilah alasan pemberian nama ’asam’ kepada molekul polinukleotida meskipun di dalamnya juga terdapat banyak basa N. Kenyataannya, asam nukleat memang merupakan anion asam kuat atau merupakan polimer yang sangat bermuatan negatif.

Sekuens asam nukleat

Telah dikatakan di atas bahwa urutan basa N akan menentukan spesifisitas suatu molekul asam nukleat sehingga biasanya kita menggambarkan suatu molekul asam nukleat cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya saja. Selanjutnya, dalam penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan untuk menempatkan ujung 5’ di sebelah kiri atau ujung 3’ di sebelah kanan. Sebagai contoh, suatu sekuens DNA dapat dituliskan 5’-ATGACCTGAAAC-3’ atau suatu sekuens RNA dituliskan 5’-GGUCUGAAUG-3’.

Jadi, spesifisitas suatu asam nukleat selain ditentukan oleh sekuens basanya, juga harus dilihat dari arah pembacaannya. Dua asam nukleat yang memiliki sekuens sama tidak berarti keduanya sama jika pembacaan sekuens tersebut dilakukan dari arah yang berlawanan (yang satu 5’→ 3’, sedangkan yang lain 3’→ 5’).

Struktur tangga berpilin (double helix) DNA

Dua orang ilmuwan, J.D.Watson dan F.H.C.Crick, mengajukan model struktur molekul DNA yang hingga kini sangat diyakini kebenarannya dan dijadikan dasar dalam berbagai teknik yang berkaitan dengan manipulasi DNA. Model tersebut dikenal sebagai tangga berplilin (double helix). Secara alami DNA pada umumnya mempunyai struktur molekul tangga berpilin ini.

Model tangga berpilin menggambarkan struktur molekul DNA sebagai dua rantai polinukleotida yang saling memilin membentuk spiral dengan arah pilinan ke kanan. Fosfat dan gula pada masing-masing rantai menghadap ke arah luar sumbu pilinan, sedangkan basa N menghadap ke arah dalam sumbu pilinan dengan susunan yang sangat khas sebagai pasangan - pasangan basa antara kedua rantai. Dalam hal ini, basa A pada satu rantai akan berpasangan dengan basa T pada rantai lainnya, sedangkan basa G berpasangan dengan basa C. Pasangan-pasangan basa ini dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang lemah (nonkovalen). Basa A dan T dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap dua, sedangkan basa G dan C dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap tiga. Adanya ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua rantai polinukleotida terikat satu sama lain dan saling komplementer. Artinya, begitu sekuens basa pada salah satu rantai diketahui, maka sekuens pada rantai yang lainnya dapat ditentukan.

Oleh karena basa bisiklik selalu berpasangan dengan basa monosiklik, maka jarak antara kedua rantai polinukleotida di sepanjang molekul DNA akan selalu tetap. Dengan perkataan lain, kedua rantai tersebut sejajar. Akan tetapi, jika rantai yang satu dibaca dari arah 5’ ke 3’, maka rantai pasangannya dibaca dari arah 3’ ke 5’. Jadi, kedua rantai tersebut sejajar tetapi berlawanan arah (antiparalel).

3’

5’
5’
3’

Gambar 2.3. Model struktur tangga berpilin DNA

P = fosfat S =gula

A = adenin, G = guanin, C = sitosin, T =timin

Jarak antara dua pasangan basa yang berurutan adalah 0,34 nm. Sementara itu, di dalam setiap putaran spiral terdapat 10 pasangan basa sehingga jarak antara dua basa yang tegak lurus di dalam masing-masing rantai menjadi 3,4 nm. Namun, kondisi semacam ini hanya dijumpai apabila DNA berada dalam medium larutan fisiologis dengan kadar garam rendah seperti halnya yang terdapat di dalam protoplasma sel hidup. DNA semacam ini dikatakan berada dalam bentuk B atau bentuk yang sesuai dengan model asli Watson-Crick. Bentuk yang lain, misalnya bentuk A, akan dijumpai jika DNA berada dalam medium dengan kadar garam tinggi. Pada bentuk A terdapat 11 pasangan basa dalam setiap putaran spiral. Selain itu, ada pula bentuk Z, yaitu bentuk molekul DNA yang mempunyai arah pilinan spiral ke kiri. Bermacam-macam bentuk DNA ini sifatnya fleksibel, artinya dapat berubah dari yang satu ke yang lain bergantung kepada kondisi lingkungannya.

Modifikasi struktur molekul RNA

Tidak seperti DNA, molekul RNA pada umumnya berupa untai tunggal sehingga tidak memiliki struktur tangga berpilin. Namun, modifikasi struktur juga terjadi akibat terbentuknya ikatan hidrogen di dalam untai tunggal itu sendiri (intramolekuler).

Dengan adanya modifikasi struktur molekul RNA, kita mengenal tiga macam RNA, yaitu RNA duta atau messenger RNA (mRNA), RNA pemindah atau transfer RNA (tRNA), dan RNA ribosomal (rRNA). Struktur mRNA dikatakan sebagai struktur primer, sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan sebagai struktur sekunder. Perbedaan di antara ketiga struktur molekul RNA tersebut berkaitan dengan perbedaan fungsinya masing-masing.

Sifat-sifat Fisika-Kimia Asam Nukleat

Di bawah ini akan dibicarakan sekilas beberapa sifat fisika-kimia asam nukleat. Sifat-sifat tersebut adalah stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung.

Stabilitas asam nukleat

Ketika kita melihat struktur tangga berpilin molekul DNA atau pun struktur sekunder RNA, sepintas akan nampak bahwa struktur tersebut menjadi stabil akibat adanya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang berpasangan. Padahal, sebenarnya tidaklah demikian. Ikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan basa hanya akan sama kuatnya dengan ikatan hidrogen antara basa dan molekul air apabila DNA berada dalam bentuk rantai tunggal. Jadi, ikatan hidrogen jelas tidak berpengaruh terhadap stabilitas struktur asam nukleat, tetapi sekedar menentukan spesifitas perpasangan basa.

Penentu stabilitas struktur asam nukleat terletak pada interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat.

Pengaruh asam

Di dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya HClO4 dengan suhu lebih dari 100ºC, asam nukleat akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen-komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat dikatakan bersifat apurinik.

Pengaruh alkali

Pengaruh alkali terhadap asam nukleat mengakibatkan terjadinya perubahan status tautomerik basa. Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral sekalipun, RNA jauh lebih rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA karena adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya.

Denaturasi kimia

Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.

Viskositas

DNA kromosom dikatakan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi karena diameternya hanya sekitar 2 nm, tetapi panjangnya dapat mencapai beberapa sentimeter. Dengan demikian, DNA tersebut berbentuk tipis memanjang. Selain itu, DNA merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA akan mempunyai viskositas yang tinggi. Karena sifatnya itulah molekul DNA menjadi sangat rentan terhadap fragmentasi fisik. Hal ini menimbulkan masalah tersendiri ketika kita hendak melakukan isolasi DNA yang utuh.

Kerapatan apung

Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung (bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi ke dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini dikenal sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium density gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik.

Oleh karena dengan teknik sentrifugasi tersebut pelet RNA akan berada di dasar tabung dan protein akan mengapung, maka DNA dapat dimurnikan baik dari RNA maupun dari protein. Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk keperluan analisis DNA karena kerapatan apung DNA (ρ) merupakan fungsi linier bagi kandungan GC-nya. Dalam hal ini, ρ = 1,66 + 0,098% (G + C).

Gambar 2.4. Sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan

Sifat-sifat Spektroskopik-Termal Asam Nukleat

Sifat spektroskopik-termal asam nukleat meliputi kemampuan absorpsi sinar UV, hipokromisitas, penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan kemurnian DNA, serta denaturasi termal dan renaturasi asam nukleat. Masing-masing akan dibicarakan sekilas berikut ini.

Absorpsi UV

Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV karena adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik; fosfat dan gula tidak memberikan kontribusi dalam absorpsi UV. Panjang gelombang untuk absorpsi maksimum baik oleh DNA maupun RNA adalah 260 nm atau dikatakan λmaks = 260 nm. Nilai ini jelas sangat berbeda dengan nilai untuk protein yang mempunyai λmaks = 280 nm. Sifat-sifat absorpsi asam nukleat dapat digunakan untuk deteksi, kuantifikasi, dan perkiraan kemurniannya.

Hipokromisitas

Meskipun λmaks untuk DNA dan RNA konstan, ternyata ada perbedaan nilai yang bergantung kepada lingkungan di sekitar basa berada. Dalam hal ini, absorbansi pada λ 260 nm (A260) memperlihatkan variasi di antara basa-basa pada kondisi yang berbeda. Nilai tertinggi terlihat pada nukleotida yang diisolasi, nilai sedang diperoleh pada molekul DNA rantai tunggal (ssDNA) atau RNA, dan nilai terendah dijumpai pada DNA rantai ganda (dsDNA). Efek ini disebabkan oleh pengikatan basa di dalam lingkungan hidrofobik. Istilah klasik untuk menyatakan perbedaan nilai absorbansi tersebut adalah hipokromisitas. Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik (kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap dsDNA.

Penghitungan konsentrasi asam nukleat

Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai A260-nya. Molekul dsDNA dengan konsentrasi 1mg/ml mempunyai A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi yang sama untuk molekul ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. Nilai A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan perkiraan karena kandungan basa purin dan pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak selalu sama, dan nilai A260 purin tidak sama dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang selalu mempunyai kandungan purin dan pirimidin sama, nilai A260 -nya sudah pasti.

Kemurnian asam nukleat

Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui penentuan nisbah A260 terhadap A280. Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar 1,8. Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Protein, dengan λmaks = 280 nm, tentu saja mempunyai nisbah A260 /A280 kurang dari 1,0. Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein.

Denaturasi termal dan renaturasi

Di atas telah disinggung bahwa beberapa senyawa kimia tertentu dapat menyebabkan terjadinya denaturasi asam nukleat. Ternyata, panas juga dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat. Proses denaturasi ini dapat diikuti melalui pengamatan nilai absorbansi yang meningkat karena molekul rantai ganda (pada dsDNA dan sebagian daerah pada RNA) akan berubah menjadi molekul rantai tunggal.

Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata sangat berbeda. Pada RNA denaturasi berlangsung perlahan dan bersifat acak karena bagian rantai ganda yang pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada bagian rantai ganda yang panjang. Tidaklah demikian halnya pada DNA. Denaturasi terjadi sangat cepat dan bersifat koperatif karena denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya.

Suhu ketika molekul asam nukleat mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel DNA, dan berkisar dari 80 ºC hingga 100ºC untuk molekul-molekul DNA yang panjang.

DNA yang mengalami denaturasi termal dapat dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan. Laju pendinginan berpengaruh terhadap hasil renaturasi yang diperoleh. Pendinginan yang berlangsung cepat hanya memungkinkan renaturasi pada beberapa bagian/daerah tertentu. Sebaliknya, pendinginan yang dilakukan perlahan-lahan dapat mengembalikan seluruh molekul DNA ke bentuk rantai ganda seperti semula. Renaturasi yang terjadi antara daerah komplementer dari dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi.

Superkoiling DNA

Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau closed-circular (CC), misalnya DNA plasmid dan kromosom bakteri serta DNA berbagai virus. Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan satu sama lain dihubungkan sesuai dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA tersebut.

Sejumlah sifat muncul dari kondisi sirkuler DNA. Cara yang baik untuk membayangkannya adalah menganggap struktur tangga berpilin DNA seperti gelang karet dengan suatu garis yang ditarik di sepanjang gelang tersebut. Jika kita membayangkan suatu pilinan pada gelang, maka deformasi yang terbentuk akan terkunci ke dalam sistem pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai superkoiling.

Interkalator

Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling dapat berubah akibat beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya. Sebagai contoh, peningkatan suhu dapat menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan kekuatan ionik dapat menambah jumlah pilinan. Salah satu faktor yang penting adalah keberadaan interkalator seperti etidium bromid (EtBr). Molekul ini merupakan senyawa aromatik polisiklik bermuatan positif yang menyisip di antara pasangan-pasangan basa. Dengan adanya EtBr molekul DNA dapat divisualisasikan menggunakan paparan sinar UV.

Dasar - Dasar Teknologi DNA Rekombinan

2009-01-21T02:04:00.000+07:00

Pengertian Teknologi DNA Rekombinan
Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.
Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.
...

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.
Enzim Restriksi
Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1. Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.
Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut.
DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi.
Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA. Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.
Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya.
Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika.
Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
1.      mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA
2.      memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya
3.      menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Gambar 11.3 memperlihatkan beberapa enzim restriksi beserta tempat pengenalannya.
Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.
Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif.
Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Ligasi Molekul - molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).
Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.
Transformasi Sel Inang
Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli.
Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5ºC. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45ºC selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil.
Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidak-tidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan.
Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid (lihat Bab XI). Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR dapat dilihat pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X). Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

Global Warming - Point Of No Return???

2009-01-21T00:19:00.000+07:00

...

Mekanisme Gerak Sayap Pada Insecta

2009-01-12T22:40:00.000+07:00

Sayap lalat bergetar menurut sinyal listrik yang dihantarkan oleh saraf. Contohnya, pada belalang setiap satu sinyal saraf menghasilkan satu pengerutan otot yang akibatnya menggerakkan sayap. Dua kelompok otot yang berlawanan, yang dikenal sebagai “pengangkat” dan “peredam” menjadikan sayap bergerak naik dan turun dengan menarik dalam arah yang berlawanan.

Jangkrik mengepakkan sayapnya dua belas hingga lima belas kali per detik, namun serangga yang lebih kecil perlu jumlah kepakan yang lebih tinggi agar dapat terbang. Contohnya, jika lebah madu, tawon dan lalat mengepakkan sayapnya 200 hingga 400 kali per detik, jumlah ini meningkat hingga 1000 kali pada ngengat dan beberapa parasit sepanjang 1 milimeter. Bukti lain yang jelas tentang penciptaan yang sempurna adalah bahwa makhluk terbang sepanjang 1 milimeter mampu mengepakkan sayapnya dengan jumlah yang luar biasa mencapai seribu kali per detik tanpa membakar, mengoyak, atau pun melelahkan serangga itu.

Telah disebutkan bahwa sayap mereka digerakkan dengan perantaraan sinyal listrik yang dikirimkan melalui saraf. Akan tetapi, suatu sel saraf hanya mampu menghantarkan sebanyak-banyaknya 200 sinyal per detik.

Lalat yang mengepakkan sayapnya 200 kali per detik memiliki hubungan saraf-otot yang berbeda dengan yang terdapat pada belalang. Terdapat satu sinyal yang dialirkan untuk setiap 10 kepakan sayap. Di samping itu, otot yang dikenal sebagai otot serat bekerja dengan pola yang berbeda dengan otot-otot belalang. Sinyal saraf hanya memerintahkan otot bersiap untuk terbang dan, ketika otot mencapai tingkat tegangan tertentu, otot pun mengendur dengan sendirinya.

Terdapat suatu sistem pada lalat, lebah madu, dan tawon yang mengubah kepak sayap menjadi gerakan “otomatis.” Otot-otot yang memungkinkan penerbangan pada serangga-serangga ini tidak terikat langsung pada tulang-tulang tubuh. Sayap menempel ke dada dengan persendian yang berguna sebagai poros. Otot yang menggerakkan sayap dihubungkan dengan permukaan bawah dan atas dada. Ketika otot-otot tersebut mengerut, dada bergerak dalam arah berlawanan, yang pada gilirannya menimbulkan tarikan ke bawah.

Mengendurkan sekelompok otot secara otomatis menghasilkan pengerutan kelompok yang berlawanan yang diikuti dengan pengenduran. Dengan kata lain, hal ini merupakan suatu “sistem otomatis.” Dengan cara ini, gerakan otot berlanjut tanpa henti hingga sinyal pemberitahuan berlawanan dikirimkan melalui saraf yang mengendalikan sistem tersebut.

SISTEM SAYAP BERIMBANG GANDA

Beberapa jenis lalat mengepakkan sayapnya hingga seribu kali dalam satu detik. Untuk mencapai gerakan luar biasa ini, satu sistem yang amat istimewa diciptakan. Sebagai ganti menggerakkan sayap secara langsung, otot mendorong suatu jaringan khusus tempat sayap melekat melalui sendi seperti poros. Jaringan khusus ini memungkinkan sayap mengepak berkali-kali dalam satu tarikan.

Otot terbang dari banyak serangga seperti belalang dan capung mengerut sangat kuat akibat rangsangan yang ditimbulkan saraf-saraf yang mengendalikan setiap gerakannya. Pada belalang, misalnya, sinyal-sinyal kiriman setiap saraf menyebabkan otot-otot terbang mengerut. Dengan bekerja bergantian, tidak saling berlawanan, dua kelompok otot yang saling melengkapi, yang dinamakan elevator (pengangkat) dan depresor (penurun), memungkinkan sayap-sayap terangkat dan mengepak ke bawah. Belalang mengepakkan sayapnya 12 hingga 15 kali per detik, dan agar dapat terbang serangga-serangga lebih kecil harus mengepakkan sayapnya lebih cepat lagi. Lebah madu, tawon dan lalat mengepakkan sayap 200 hingga 400 kali per detik, dan pada ganjur dan sejumlah serangga merugikan yang berukuran hanya 1 milimeter (0.03 inci), kecepatan ini meningkat ke angka mengejutkan 1000 kali per detik, Sayap-sayap yang mengepak terlalu cepat untuk dapat dilihat mata manusia telah diciptakan dengan rancangan khusus agar dapat melakukan kerja yang terus-menerus semacam ini.

Otot-otot penerbangan dari banyak serangga seperti capung mengerut sangat kuat akibat rangsangan yang ditimbulkan oleh saraf-saraf yang mengendalikan setiap gerakan mereka

Pada perangkat istimewa ini, yang masing-masing diciptakan tersendiri pada tubuh setiap serangga, tak dijumpai ketidakteraturan sedikit pun. Saraf-sarafnya tidak pernah mengirim sinyal yang salah, dan otot-otot serangga senantiasa menerjemahkannya secara benar.

Otot – otot tergosternal dan otot-otot dorsal longitudinal dikenal sebagai otot sayap yang tidak langsung karena mereka menghasilkan efek (menaik dan gerak-menurun dari sayap) secara tidak langsung dengan mengubah bentuk dari rongga dada. Kontraksi dari otot-otot tergosternal menekan notum dan menghasilkan gerak naik sayap, posisi yang sangat penting selama proses terbang. Kontraksi otot-otot dorsal longitudinal menghasilkan lengkungan yang menaik pada notum, menghasilkan suatu gerak-menurun dari sayap-sayap. Otot-otot basalar menghasilkan suatu gerak-menurun basalar, yang pada gilirannya (oleh karena koneksinya dengan pinggiran kosta dari sayap) mengakibatkan suatu tekanan pada pinggiran kosta sayap dan/atau satu perluasan (gerakan majua) dari sayap-sayap. Otot-otot subalar meluaskan sayap atau menekan tepi belakang sayap. Otot-otot axillary menggerakkan sayap mundur dan melenturkan otot – ototnya dengan memutar axillary dorsal yang ketiga menuju ke dalam.

Pada jenis seperti lalat dan lebah, otot-otot yang memungkinkan terbang bahkan tidak menempel pada pangkal sayap. Sebaliknya, otot-otot ini melekat pada dada melalui pengait yang berperan seperti engsel, sedangkan otot-otot yang mengangkat sayap ke atas melekat pada permukaan atas dan bawah dada. Saat otot-otot ini mengerut, permukaan dada menjadi rata dan menarik pangkal sayap ke bawah. Permukaan samping sayap memberikan peran penyokong sehingga memungkinkan sayap-sayap terangkat. Otot-otot yang menimbulkan gerakan ke bawah tidak melekat langsung pada sayap, tapi bekerja di sepanjang dada. Ketika otot-otot ini mengerut, dada tertarik kembali ke arah berlawanan, dan dengan cara ini sayap tergerakkan ke bawah.

Engsel sayap tersusun atas protein khusus yang dikenal sebagai resilin, yang memiliki kelenturan luar biasa. Karena sifatnya jauh mengungguli karet alami ataupun buatan, para insinyur kimia berupaya membuat tiruan bahan ini, di laboratorium. Saat melentur dan mengerut, resilin mampu menyimpan hampir keseluruhan energi yang dikenakan padanya, dan ketika gaya yang menekannya dihilangkan, resilin mampu mengembalikan keseluruhan energi itu. Alhasil, daya guna (efisiensi) resilin dapat mencapai 96%. Saat sayap terangkat, sekitar 85% energi yang dikeluarkan disimpan untuk saat berikutnya; energi yang sama ini kemudian digunakan kembali dalam gerakan ke bawah yang memberikan daya angkat ke atas dan mendorong sang serangga ke depan. Permukaan dada dan ototnya telah diciptakan dengan rancangan istimewa untuk memungkinkan pengumpulan energi ini. Namun, energi tersebut sesungguhnya disimpan pada engsel yang terdiri atas resilin. Sudah pasti mustahil bagi seekor serangga, dengan usahanya sendiri, melengkapi diri sendiri dengan peralatan luar biasa untuk terbang. Kecerdasan dan kekuatan tak terhingga Allah telah menciptakan resilin istimewa ini pada tubuh serangga.

Lebah madu, tawon dan lalat mengepakkan sayap mereka 200 hingga 400 kali per detik.

Untuk penerbangan yang mulus, gerakan lurus ke atas dan ke bawah saja tidaklah cukup. Agar dapat memunculkan gaya angkat dan gaya dorong, sayap haruslah pula mengubah sudut gerakannya di setiap kepakan. Sayap-sayap serangga memiliki kelenturan berputar yang khas, tergantung jenisnya, yang dimungkinkan oleh apa yang disebut sebagai direct flight muscles (otot-terbang kemudi), disingkat DFM yang menghasilkan gaya-gaya yang diperlukan untuk terbang.

Ketika serangga berupaya naik lebih tinggi di udara, mereka memperbesar sudut sayap mereka dengan mengerutkan otot-otot di antara engsel-engsel sayap ini secara lebih kuat. Rekaman gambar berkecepatan-tinggi dan gerak-terhenti memperlihatkan bahwa selama terbang, sayap-sayap tersebut bergerak mengikuti lintasan lingkar-telur dan untuk setiap kali putaran sayap, sudutnya berubah secara teratur. Perubahan ini disebabkan pergerakan yang senantiasa berubah dari otot-terbang kemudi dan penempelan sayap pada tubuh.

Banyak jenis serangga, termasuk belalang, memperhatikan apa yang ditangkap penglihatannya seperti garis kaki langit (horizon) untuk menentukan arah terbang dan tujuan akhirnya. Untuk mengokohkan keseimbangan kedudukannya, lalat telah diciptakan dengan rancangan yang lebih luar biasa lagi. Serangga-serangga ini memiliki hanya sepasang sayap, tapi di sisi belakang masing-masing sayap itu terdapat tonjolan melingkar yang dikenal sebagai halter (pengekang). Meskipun tidak menghasilkan gaya angkat, pengekang ini bergetar bersama sayap-sayap depan. Di saat serangga mengubah arah terbangnya, tonjolan sayap ini mencegahnya menyimpang dari jalur perjalanan.

Untuk penerbangan yang mulus, gerakan sayap lurus ke atas dan ke bawah tidaklah cukup. Sayap mesti pula mengubah sudut gerakannya di setiap kepakan. Sayap-sayap serangga memiliki kelenturan-berputar yang istimewa yang diberikan oleh otot-otot pengendali penerbangan.

Gambar di atas menunjukkan pergerakan sayap capung ketika terbang. Sayap depan ditandai dengan bintik merah. Pengamatan lebih dekat memperlihatkan bahwa pasangan sayap depan dan belakang dikepakkan dengan irama yang berbeda, yang memberi sang serangga cara terbang yang luar biasa. Gerakan sayap tersebut dimungkinkan oleh otot-otot khusus yang bekerja dengan selaras

Sistem sayap berimbangan ganda ditemukan bekerja pada serangga yang kurang sering mengepakkan sayap.

Bahan Kimia Berbahaya

2009-01-12T21:23:00.000+07:00

Ajinomoto, Racun Yang Sedaapp!!

Di zaman yang makin modern, gaya hidup-pun terus berkembang. Orang lebih suka makan makanan yang enak. Oleh sebab itu, banyak makanan yang menggunakan Ajinomoto sebagai “penyedap rasa”. Ajinomoto merupakan bumbu kimia yang disebut Monosodium Glutamate (MSG). Otak kita memiliki banyak reseptor untuk MSG dan beberapa area, seperti hypothalamus, namun tidak memiliki membrane impermeable sehingga MSG dapat masuk ke otak dan melukai bahkan mematikan sel – sel saraf otak. Akibatnya orang mengalami degeneratif saraf otak mengakibatkan menurunnya daya ingat (pikun).

Agar terhindar dari serangan MSG maka makanlah makanan yang tidak mengandung MSG. Bagi ibu – ibu rumah tangga, masaklah makanan tanpa menggunakan penyedap rasa, mungkin dapat ganti dengan menambahkan gula yang dapat menambah rasa gurih atau menambah garam agar masakan tidak terasa hambar.

MIND MAPPING :

Gaya hidup makan enak ajinomoto

Otak

Melukai dan mematikan sel – sel saraf otak

Degenerasi saraf otak

Menurunkan daya ingat

KICKED YOUR BAD HABBITS

2009-01-12T20:37:00.000+07:00

To know well about someone, you have to know about the characteristic and the personality. Now, I want to tell you about my characteristic. It’s not only my goodness but also my badness.
One of my badness is forgetfull. I often forget to do the tasks from my teacher, so I never assign and collect the tasks. Beside that I am is a pessimistic person and easy to be hopeless. When I have a problem, I always think that I can’t survive because I have no strength. It will make me feel hopeless. However I have some goodness. The first, I’m is a care person. I help my friends if they have a problem. I will be a good istner and help them to find the solution. The second, I’m not a stingy person. For instance in time problem. I will help my friends to understand about the lessons although I have no more time to myself to study. I will teach them until they feel really understand. The last I am is a lovable boy, because I have ‘something’ that interest the other.
I want to be a better and a real person. So, I must throw out all of my badness.

First, for forgetfull, I must modify my environment. I can use a simple technique. I must often places small fluorescent reminder notes at eye level on the inside of the frame of my bedroom door. A recent one read “Remember to prepare your presentation about HOMEOSTASIS or Mr. Djohan will kill you.” ( Here I was using exaggeration to good efect).

After I’m modify my environment, I must monitor my behavior, because if I monitor what I do, I will probably do better. I can keep a record of what tasks I want to do. So, I will probably start doing all of the tasks.

Make a commitment is another key for me to throw out my badness (forgetfull), because I think when you make commitment to another person, you establish what psychologists call a contingency of reinforcement; you’ve automatically arranged for a reward if you comply and a punishment if you don’t. It puts some pressure on you, and that’s often just what you need.
For example, I can make commitment with my father or my mother.
If I don’t do homework from my teachers, my parents will kill me.
So, with this commitment I believe I can do all the homework because if I don’t do that, my parents will kill me.

If I always think pessimistic and be hopeless, it shows that I don’t trust GOD. Now, I know I must give all my problem, everything, especially my life in GOD’s hands and let GOD done for me. One thing that I remember, I never be alone because GOD always here for me. His promises are true and never be late. I want to start it with say thanks to GOD for everything I got, bad or good. For my goodness, I just want that I can serve my GOD through the people around me. I just want to forward what I had from GOD, so everybody sees and knows that GOD is really good.